肿瘤抗原致敏树突状细胞治疗胶质瘤的实验研究

1、肿瘤抗原致敏树突状细胞治疗胶质瘤的实验研究        【摘要】     目的 研究肿瘤冻融抗原致敏树突状细胞（DC）治疗胶质瘤的疗效。方法 从大鼠骨髓中分离出单核细胞后，加入添加rGMCSF和rIL4的IMDM培养基中培养后鉴定。制备大鼠C6胶质瘤冻融抗原以及DC疫苗，同时肿瘤冻融抗原致敏DC体外细胞毒试验；建立动物模型，体内应用DC疫苗并观察疗效。结果 单核细胞培养8天后可获得大量的树突状细胞；体外细胞毒试验发现对相应的C6肿瘤细胞有明显的杀伤作用；动物实验发

2、现治疗组肿瘤生长明显抑制，而对照组肿瘤明显生长，两组肿瘤体积有显著性差异P<0.01。结论 建立了体外扩增大鼠骨髓DC以及制备DC疫苗的方法,采用冻融抗原致敏DC疫苗治疗荷瘤动物生存时间明显延长，肿瘤生长明显抑制，为研究其在脑胶质瘤临床免疫治疗打下基础。     【关键词】  树突状细胞；脑胶质瘤；免疫治疗；冻融抗原    Experimental Study of Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates for

3、 Immunotherapy of C6 GliomaLIU Zaiming, LEI Ting, NIU Hongquan, DONG Fangyong, DONG Zheng, WANG Yu, XUE DelinDepartment of Neurosurgery, Tongji hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, ChinaAbstract：Objective  To investigate effect of dendri

4、tic cells pulsed with tumor antigens which are used to treat with intracranial glioma.Methods  dendritic cells were isolated from rat bonemarrow precursors stimulated in vitro with granulocytemacrophage colonystimulating factor (GMCSF) and interleukin4 (IL4).Then mature DCs were analyzed; Produ

5、ce lysates and dendritic cells vaccinum; then we established animal model treated with dendritic cells vaccinum. The rat brains were then removed and examined histologically,and spleens were harvested for cellmediated cytotoxicity assays.Results  Mature dendritic cells with typical cloved leafs

6、haped nucleus and long cytoplasmic dendrites, immunocytochemisty showed expressions of OX6 and OX62 were positive, cellmediated cytotoxicity assays showed that there were statistically significant compared with control cells. At necropsy, the size of neoplasm is larger in tumor than control group (P

7、<0.01).Conclusion A method to generate large number of dendritic cells from rat bonemarrow in vitro and manufacture dendritic cells vaccinum is established, and dendritic cells pulsed with lysate could inhibit significantly the growth of tumor; which may contribute to further study on the role of

8、 them in the immuntherapy of brain glioma.Key words：Dendritic cells;Glioma; Immuntherapy; Tumor lysates0  引言    树突状细胞（dendritic cells，DC）作为功能最强的抗原提呈细胞，能激活静息型T细胞，激发初始免疫应答。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术应用于DC瘤苗构建方法的发现， DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。我们建立了利用大鼠骨髓分离培养和鉴定树突状细胞以及制备树突状细胞疫苗的方法, 并观察了DC疫苗治疗

9、脑胶质瘤的疗效，为脑胶质瘤免疫治疗提供理论基础。1  材料和方法1.1  材料和试剂仪器  成年清洁级SD大鼠（雄性），体重(200±20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。C6细胞株（同济医院神经外科实验室提供），IMDM培养基、1640培养基、胎牛血清（Gibco 公司），rGMCSF与rIL4（Protechec 公司），SABC免疫组化染色试剂盒(博士德公司)。1.2  大鼠骨髓来源DC的提取和培养  断颈处死SD大鼠,固定后消毒双下肢，取出胫、腓骨。以下在无菌台内操作,70%的乙醇中及PBS漂洗。将胫、腓骨两端剪

10、掉直止红骨髓,用IMDM液将骨髓冲出至培养皿中。尼龙滤膜过滤。将过滤后的IMDM悬液离心, 加入红细胞裂解液, 离心。细胞沉淀加入IMDM完全培养液, 再加入rIL4 (500U/ml,终浓度), rGMCSF (500U/ml,终浓度)。37, 5%CO2湿化培养。接种后2天半量换液, 第4、6 天只补充rIL4, rGMCSF。1.3  大鼠骨髓来源DC的鉴定  分别在第18天用相差显微镜观察DC细胞。取培养8天的细胞离心收集细胞沉淀， 2.5%的戊二醛固定2小时， 漂洗， 置入4预冷的1%饿酸固定2小时， 梯度乙醇脱水， 包埋, 切片染色, 透射电镜观察。采用博士德公

11、司即用型SABC免疫组化染色试剂盒, DAB显色对DC细胞进行免疫组化鉴定； 同时表达OX62+,OX6+的细胞是DC细胞,  严格按试剂盒说明进行。1.4  大鼠C6胶质瘤DC疫苗的制备  收集对数生长期的C6胶质瘤细胞，放入液氮中，10min后取出迅速放入37水浴完全融化再放入液氮中，反复4次。稀释至1ml，用微孔滤膜过滤，4保存备用。在培养4天的DC中加入C6胶质瘤冻融抗原，比例为13。培养至8天收集DC并计数，既制成大鼠C6胶质瘤DC疫苗。1.5  负载冻融抗原DC动物实验体外细胞毒试验(MTT法)  C6胶质瘤细胞制成靶细胞。制备效应

12、细胞, 为单纯DC，DC+C6胶质瘤细胞，DC+C6胶质瘤细胞冻融抗原3组。取C6胶质瘤细胞106个接种于大鼠腹部皮下。一周后无菌取荷瘤小鼠脾脏，获得T细胞。T细胞加RPMI1640液3 ml，10% FCS，IL2 （10U/ml，终浓度），再加入不同的3组效应细胞，DC和T细胞为150。37，5%CO2，湿化培养5天，制成效应细胞CTL。用MTT法检测：（试剂：MTT工作液，5mg/ml；萃取液以10g SDS + 99.4mlDMSO + 0.6ml乙酸制成）将效靶细胞按101, 51, 2.51加入96孔板, 每孔靶细胞C61500个,总体积100l,37×4h,振荡培养。每

13、孔加入MTT工作液10l, 37×3h,振荡培养。吸弃上清60l, 加入萃取液100l, 37×2h,振荡培养。在酶标仪上检测各孔OD值，检测波长550nm,参考波长620nm。CTL杀伤活性=1-实验组杀伤后靶细胞OD值未杀伤靶细胞OD值×100%1.6  大鼠C6脑胶质瘤动物模型的建立  动物共分3组： A组，大鼠C6脑胶质瘤动物模型治疗组； B组， 大鼠C6脑胶质瘤动物模型非治疗组； C组， 空白组。A组10只， B组10只， C组5只。 C6脑胶质瘤模型的建立: 称重， 6%水合氯醛腹腔注射。大鼠麻醉后固定在立体定向手术台上， 作右前额

14、中线旁3mm直切口， 以自制磨钻磨开3×3mm大小骨窗。 无菌条件下， 采用立体定向技术， 用微量进样器向右侧顶叶皮层下2mm注射C6细胞106个（10l）。 缝合头皮， 常规饲养。 A组大鼠， 在接种后第2天的C6脑胶质瘤动物模型皮下注射大鼠C6胶质瘤DC疫苗0.5ml， 每只注射DC约2×106个。1.7  大鼠脑标本的处理  A组和B组第10天及第20天取脑，C组在第1天取脑。直接取脑后-80冻存制片。以接种的部位为中心冠状将脑组织分割成三块，石蜡固定，制作组织病理切片，厚度为5m，常规HE染色。同时进行组织病理切片图像分析，显微镜下借助图像分析仪

15、测量肿瘤体积V=L×S2;L和S分别代表肿瘤组织冠状最大切面的最长径或最短径。2  结果2.1  相差显微镜观察  48h后,DC在培养基中呈悬浮生长,含用大量单核细胞和红细胞；第35天,细胞贴壁生长, 红细胞大部分消失, 单核细胞比例增加；58天后,大量悬浮细胞形态不规则, 细胞有伸展的毛刺。2.2  透射电镜  成熟的树突状细胞大小1520m,胞体呈不规则形态,细胞表面树状突起。2.3  免疫组织化学技术分析  培养的DC细胞第8天,细胞可表达OX62+和OX6+，见图1A、1B。2.4  肿瘤冻融抗

16、原致敏树突状细胞动物实验体外细胞毒试验C6抗原DC为88.32%、65.49%、50.93%；C6+DC为30.76%、22.21%、15.38%；DC为20.21%、15.13%、13.67%。统计学分析示C6抗原DC与C6+DC相比P0.01,C6抗原DC和DC相比P0.01。2.5  病理切片结果分析  组织病理切片示实验组可见肿瘤生长明显抑制，对照组肿瘤明显生长，见图2、3。2.6  动物生存曲线  对照组生存时间(19.76±10.56)天，治疗组生存时间(37.68±15.23)天。两组之间有显著性差异P<0.01,

17、见图4。图4  动物生存曲线（略）2.7  组织病理切片图像分析  C6细胞接种后10天，20天后实验组和对照组各取5只大鼠测量脑内肿瘤体积。对照组肿瘤大小(mm3)：10天 56.55±1.38，20天69.73±1.13；实验组肿瘤大小：10天 11.78±0.91, 20天 21.78±1.22。统计学分析两对照组肿瘤体积无显著性差异（P>0.05）, 两治疗组肿瘤体积无显著性差异（P>0.05）,而治疗组肿瘤体积显著小于对照组（P<0.01）。3  讨论   

18、 DC在机体分布广泛但数量极少,它们只占外周血单核细胞的0.5%。DC数量甚微极大的限制了DC的研究和应用。DC主要来源于骨髓和血液,在不同因素的作用下,分别发育成为各种类型的DC。Fresnay1报告用GMCSF和IL4体外扩增骨髓来源DC。本实验选择了同时用GMCSF和IL4协同诱导培养大鼠骨髓DC；经过体外培养扩增,从每只大鼠骨髓中可以得到8×107的DC。确定一种细胞是否为树突状细胞需从形态学，特异性标志等多方面来考虑，不同的种属其表面标志可以不同，大鼠树突状细胞的表面标志OX62+，OX6+。OX62为一粘附分子，OX6是MHC II分子。尽管MHC II分子在OX62的某

19、些细胞表达，但表达OX6和OX62的细胞一定为树突状细胞。一般认为, 脑组织是免疫特赦部位，据目前的研究, 脑组织中可能存在树突状细胞,一些细胞在某些情况下可以转化为树突状细胞。Nunez2等成功地建立脑组织来源的树突状细胞系AG116,将AG116与肿瘤抗原和T细胞一起培养,可以促进T细胞增殖和IL2产生, 增加IL6、IL12、p40的分泌。正常情况下,人脑中树突状细胞的功能受到抑制,这与其表面不能表CD80、CD86等分子有关3。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展4。因此在临床治疗中着重于增加DC的数量和改善DC的功能,但这必须经过

20、DC的提取,在体外培养、扩增以及加入抗原制成疫苗的过程。将肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原在体外对DC进行致敏,致敏后的DC就可以有效地激活针对表达该抗原肿瘤的CTL细胞的活性，但目前多数肿瘤包括胶质瘤都缺乏肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原,且某些抗肿瘤T细胞反应需要广谱的抗原,而不是单一的抗原,因此目前应用较多的还是肿瘤全抗原。Mule5报道体外用负载了肿瘤溶解物的DC作为刺激剂可训化同系鼠T细胞，导致肿瘤特异性T细胞增殖及细胞因子的产生；在临床实验中，负载了黑色素瘤细胞溶解物和匙孔血蓝蛋白（KLH）的DC疫苗免疫后产生了KLH特异性T细胞反应，并产生记忆性CTL。Fecci6研究DC疫苗由于治疗淋

21、巴瘤，多发性骨髓瘤，黑色素瘤，白血病和颅内肿瘤有明显效果。Liau7等人研究报告微酸洗脱肿瘤抗原肽致敏DC治疗9L胶质瘤发现能明显的增长动物生存期。我们用破碎细胞的方法提取的抗原，尽管该法提取的抗原含有非免疫原性的多肽和细胞内的溶解物，后者可导致自身免疫反应，但从动物实验并未见明显的自身免疫反应，比乳酸洗脱法提取抗原方法简便易行，并能明显抑制肿瘤生长8，9。本实验体外大量培养大鼠骨髓来源DC的方法和通过冻融抗原致敏树突状细胞制备DC疫苗的方法已建立,实验证明治疗组荷瘤动物的生存时间明显延长以及治疗组肿瘤组织生长明显抑制，进一步说明DC疫苗的有效性，为深入研究脑胶质瘤临床免疫治疗方案打下基础。(

22、本文图13见封2)（略）    【参考文献】  1 Fresnay S, Chalmers DE. Polybrene and interleukin4: two opposing factors for retroviral transduction of bonemarrowderived dendritic cellsJ.J Gene Med, 2002,4(6):601612.2 Nunez R. Revision of the functional analysis and structural features of immorta

23、lized dendritic cell lines derived form mice lacking both type I and type II interferon receptorsJ. Immunol Lett,1999,68(1):173186.3 Serot JM, Bene MC, Foliguet B,et al. Monocyte derived IL10 secreting dendritic cells in choroids piexus epitheliumJ. J Neuroimmunol, 2000, 105(2): 115119.4 Almand B, Clark JI, Nikitina E, et al. Increased production of imm