南农生物分离工程修改生物分离6凝胶ppt课件

1、第六章第六章 凝胶层析凝胶层析分子筛色谱凝胶过滤）分子筛色谱凝胶过滤） 层析法所用的凝胶颗粒大小要均一，颗粒內外贯穿许多小孔径的通路，分子量小的物质，比较容易进入颗粒中，因此被延滞流出。亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；发生任何化学或物理相互作用；稳定性强，在较宽的稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，化学试剂中保持稳定，使用寿命长，具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力流速）。机械强度高，允许较高的操作压力流速）。 l凝胶特性参数l

2、内水体积Vi：孔体积l外水体积Vo：颗粒间体积l柱床体积Vt l Vt=Vo+Vi+ Vgl Vt= Vi+Vol洗脱体积Vel Ve=Vo+KdVi lKd=(Ve-Vo)/ViA：“全排阻全排阻”， 流经体积流经体积Vo Kd=0C：“全渗入全渗入”， 流经体积流经体积Vo+Vi Kd=1B：“部分排阻或部分排阻或 Ve=Vo+KdVi 0 Kd1Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系数排阻系数” 或或“分配系数分配系数”一定规格凝胶，一定规格凝胶， Kd特征常数特征常数Kd1 物质分子与凝胶之间有吸附物质分子与凝胶之间有吸附 Tyr=1.4 G-25小分子小分子Kd1 水合作用水合作用 N

3、aCl 0.8 G 0.9整个凝胶作为固定相整个凝胶作为固定相 Vi+VgKav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系数有效分配系数分子形状不同分子形状不同M相近也可分开相近也可分开牛血清白蛋白球）、兔血红蛋白棍）牛血清白蛋白球）、兔血红蛋白棍） 68000dl排阻极限exclusion limit）l是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD。l分级范围fractionation range）l能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.530

4、 kD。 凝胶粒径凝胶粒径凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50150 m100200目），例如，目），例如，Sepharose和和Sephadex凝胶粒径分布为凝胶粒径分布为45165 m 。硬凝胶粒径较小，一般为硬凝胶粒径较小，一般为550 m 。床体积床体积bed volume）即即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为的床体积

5、为911 cm3/g干胶。干胶。空隙体积空隙体积void volume）即即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖的水溶性蓝色葡聚糖blue dextran）。）。对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此溶

6、质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近产品收率可接近100；每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；故容易实施循环操作，提高产品纯度；作为脱盐手段，作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分仅根据溶质

7、之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格控制流速；离较慢、需严格控制流速；经经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作如超滤、离子交具有浓缩作用的单元操作如超滤、离子交换和亲和色谱等后使用。换和亲和色谱等后使用。l葡聚糖系葡聚糖系l其中其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖右旋糖酐是利用葡聚糖右旋糖酐交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。烷。Sephadex凝胶按交联度大小，分凝胶按交联度大小，

8、分G 10G 200共八种型号。共八种型号。G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水吸水量量（g/g干凝干凝胶）胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作工作范围范围（肽（肽与蛋与蛋白）白）D700150050001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000l规格编号规格编号l 间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限l G-50 分离限分离限1500-30000 G-150：5000-400000l 对蛋白、多糖分离范围不同对蛋白、多糖分离范围不同l （

9、多糖分子体积比相同（多糖分子体积比相同M的蛋白大）的蛋白大）l 粒度：直径粒度：直径100-300um粗粒粗粒 l 20-80um细粒细粒 l 40-120um中粒中粒l保管保管l 湿法：悬浮于水、缓冲液中，湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5l 干法：乙醇分步处理干法：乙醇分步处理20%，40%，60%，80%）l 脱水收缩，抽滤，脱水收缩，抽滤，60-80 吹干，吹干，室温室温l 半缩法：半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，乙醇悬液，封口，4 修饰葡聚糖凝胶亲脂性 引入有机基团 Sephadex LH-20羟丙基）（原Sephadex G-25） 流动相既可使用缓冲水溶液，

10、也可使用极性有机溶剂氯仿、四氢呋喃，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 交联葡聚糖离子交换剂 引入CM-，DEAE-，离子交换、 分子筛 聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶 特点： 1.化学稳定性差，pH4-9 2.脱水、枯燥、冷冻、有机溶剂、温度高于40便融化 3.与硼酸形成配合物，孔径变化，防止 4.强度低，随凝胶浓度而，弹性小，调整柱压 5.非特异性吸附力葡聚糖，I0.01mol/l无明显吸附 6.分离的M范围大108），随凝胶浓度而 l架桥琼脂糖凝胶架桥琼脂糖凝胶 Sepharose CLl 1，3-二溴丙醇交联，孔径均匀，孔径大小和二溴丙醇交联，孔径均匀，孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但机

11、械强度分离范围与普通琼脂糖一样，但机械强度，热，热稳定性稳定性，化学稳定性，化学稳定性（pH3-14）l l超胶超胶ultro-gel ACA)l 琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶l 比比Sepharose 化学稳定性好，强度高，化学稳定性好，强度高，pH3-10，热稳定性不变，热稳定性不变l ACA 34：丙烯酰胺：丙烯酰胺3%，琼脂糖，琼脂糖4%l 分离范围：生物胶分离范围：生物胶P超胶琼脂糖超胶琼脂糖 Bio-Glas 500 孔径500 将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合 特点：化学稳定性高，强度大，耐高压， 对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化类分离分

12、级分离l粒度的选择粒度的选择l 细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析或分析l l 粗粒：粗粒： 用于粗制、用于粗制、脱盐脱盐l 将干胶颗粒悬浮于将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在沸水浴沸水浴5小时即可达到凝胶的充分溶胀。小时即可达到凝胶的充分溶胀。 加热法既可节省时间又可排气、消毒。加热法既可节省时间又可排气、消毒。 商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡 不需溶胀不需溶胀层析柱的选择层析柱的选择 柱比

13、：长度柱比：长度/直径、直径、 体积体积 类分离：类分离： 柱床体积为样品体积柱床体积为样品体积5倍或略多倍或略多 柱比柱比5:1-10:1 分级分离：分级分离：25-100倍倍 柱比柱比25-100 大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高 实验室用的层析柱工业用的层析柱 装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。 不能出现分层、倾斜、气泡 通过2-3

14、倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 进样体积洗脱 用水、缓冲液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸 温度、流速、柱压、阻力恒定 防止非特异性吸附 操作压流速快，峰宽 相当大柱压范围内 v=KP/L 相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大 部分收集器部分收集器前往自动馏分收集仪进口）再生 重复使用 流速下降、板结可反冲，取出漂洗l凝胶床的检查和维护凝胶床的检查和维护l使用时间过长、流速过大、柱高过大，使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速流速l 控制操作压：柱进出口液位差控制操作压：柱进出口液位差l凝胶的保存

15、：凝胶的保存：0.02%叠氮钠或叠氮钠或0.002%洗洗必泰必泰前往蠕动泵前往前往国产柱层析系统伯乐公司BIO-RAD柱层析系统本卷须知本卷须知1各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。破损。2装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。紧凝胶。3始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。l生物大分子溶液的脱盐生物大分子溶液的脱盐

16、l 用用 大粒度、高交联度凝胶大粒度、高交联度凝胶l 使蛋白使蛋白Kd=0，盐类，盐类Kd=1l 蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐易挥发盐洗脱，真空干燥用稀盐易挥发盐洗脱，真空干燥 样样品体积品体积Vi/3l l去热原去热原l Sephadex G-25 氨基酸氨基酸 Kd=1 热原热原Kd=0l 样品体积样品体积 30%VtlGFC可用于相对分子质量从几百到可用于相对分子质量从几百到106l 数量级的物质的分离纯化。数量级的物质的分离纯化。l l G-50除去结晶胰岛素中前胰岛素、大除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗原分子抗原l G-25除去青霉素中

17、抗原性杂质、致敏、除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子杂质高分子杂质l l右图是一例利l 用高效GFC分离骨髓l 血清蛋白质的结果。 色谱柱： 10300，Superose 6洗脱液：0.05molL磷酸盐0.15molL NaClpH7.0）流量：0.2mlmin1.IgA高聚体 2. IgA二聚体 3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数或洗脱体积与相对分子质量的对数成正比，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。 已知分子量的标准品已知分子量的标准品 测未知分子量：将

18、样品在同一凝胶柱上，同一条测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱凝胶柱洗脱体积洗脱体积分子量的对数分子量的对数绘制标准曲线绘制标准曲线凝胶层析技术进行测定凝胶层析技术进行测定主要参数测算主要参数测算 Vo通常占柱床通常占柱床30%Vo、Vi1. 重量法重量法 Vt=Vo+Vi+Vg=d2h/4 Vi=gWr g-干胶重量干胶重量 Wr-吸液量吸液量/ g干干胶胶 Vo=Vt-(Vi+Vg) Vg估算为估算为13/g干胶干胶2. 过柱法过柱法 Ve=Vo+KdVi 2106蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖Kd=0 重铬酸钾重铬酸钾 Kd=1 lKd、Kavl Kd=(Ve-Vo)/Vi l Kav= (