乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程

1、乙型肝炎病毒（HBV 核酸定量检测标准操作规程（PCR 荧光探针法）1. 目的：规范乙型肝炎病毒（HBV 核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。2. 应用范围：HBV DNA 荧光定量检测。3. 职责：3.1 文件编写：实验室技术员。3.2 文件审核：实验室主管。3.3 文件审批：实验室主任。3.4 执行：PCR 实验室所有工作人员。4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（ HBV 核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明 书。4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600 型使用说明书。5. 内容：5.1 检测方法：PCR 荧光探针法

2、。5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCE 反应液、耐热 DN 骤合酶（Taq 酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过 PCR 体外扩增法，即高温变性、低温退火、 适温延伸进行 DNAT 增，并对 PC 雀过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA5.3 性能参数：5.3.1精密度：检测下限为 5.0 x102IU/ml。5.3.2线性范围：1.0 x1031.0 x108IU/ml。5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 毫升，注入无菌

3、的干燥玻璃管， 室温（2225C）放置 3060 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm 离心 5min ;吸取上层血清，转移至 1.5ml 灭菌离心管。5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20C待测，保存期为 6 个月，应避免反复冻融。5.4.4 运送条件：标本运送采用 0C冰壶。5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。5.5 设备和试剂：5.5.1 设备：DA7600 荧光定量 PCR 仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、 恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4C、-20C）、移动/

4、固定紫外灯、冷冻离心机。5.5.2试剂:5.521试剂品牌：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR 荧光探针法)5.522试剂批准文号：国食药监械(准)字2014 第 3400032 号。5.523试剂组成：组分名称规格数量核酸提取试剂DNAt 取液 14.5ml/ 瓶2口TX I7H曰 4 -+/. 口阳性质控品250ul/ 管1HBV 虽阳性质控品250ul/ 管1HBV 缶界阳性质控品250ul/ 管1250ul/ 管1质控口仃及阳性定量参考口仃HBX 阳日性定量参考品(2.0X10 IU/ml )HBW 日性定量参考品(2.0X105IU/ml )250ul/ 管1HBW 日性定量参考

5、品(2.0X104IU/ml )250ul/ 管1HBW 日性定量参考品(2.0X103IU/ml )250ul/ 管1PCR 佥测试剂HBV 内标溶液100ul/ 管1HBV-PC 反 应管1 人份/管205.5.2.4试剂保存和有效期：保存于-20 5C;有效期 9 个月。5.5.2.6 质控品：由康切斯坦购买质控品。质控水平S4。5.6 操作过程：5.6.1 血清标本与质控品的处理：待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 虽阳性质控品、HBV 缶界阳性质控品进行同步处理。561.1打开恒温水浴箱或干式恒温器，设定温度100C。5.6.1.2 从试剂盒中取出 DN 提取液I、内标溶液、阴性质控品、HBX 阳性定j量参考品。从冰箱取出阳性质控品，让其在室温下完全融化。5.6.1.3取 450ul DNA 提取液I和4ul 内标溶液，分别加到 1.5ml 的灭菌离心管中并编号。5.6.1.4将 DNA 提取液 I、阴性质控品于振荡混匀器振荡5s, 6,000rpm 离心 5s。5.6.1.5往装有 450ul DNA 提取液 I 和内标溶液的灭菌离心管中加入待测样本血清和阳性质控品各200u