3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

1、实验五3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量:目的了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理掌握总糖定量测定的操作方法:原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。还原糖 上）HC -OH II C-OH II（HC - OHnH2C -OH0 二 C-OHH C-OHI（H C - O）nH2C-OH烯二醇糖酸（碱）=加热0H3,5-二硝基水杨酸（黄色）NO 20H3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）NH 2黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂与还原

2、糖在碱性条件下共热后，自身 被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深 浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线 并计算，便可求得样品中还原糖的含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水 解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入 的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时， 则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-21= 0.9 ），即得比较接近实际的样品中总糖含量。180三：实验材料及设备1、

3、材料：面粉2、仪器：分光光度计电子天平沸水浴3、器材:刻度试管:25mLX 8lOOmLX 2 lOOmLX 1 1mLX 2 2mL X 2 10mL X 2 250mLX 1 50mL X 111cm漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四：试剂的配制1、葡萄糖标准液（1mg/mL预先将分析纯葡萄糖置80r烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至 500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中 4C保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象， 则应弃之，重新配制。2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS式剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于

4、200mL2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含 130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至 1000mL暗处保存备用。3、碘液称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。4、酚酞指示剂称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。5、HCI 溶液（6N）取500mL12NHCI用水稀释至lOOOmL6、NaOH溶液（6N）取240gNaOH加水溶解，定容至 lOOOmL五：操作步骤1、样品中总糖的提取取材：称取O.7g面粉，准确记录实际质量（W,放入1OOmL锥形瓶中。溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸

5、馏水；再加入1OmL6NHCI，搅匀。水解：置于沸水浴中水解3O分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中,加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继 续水解。如已水解完全，贝U不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶, 冷却。中和：加1滴酚酞指示剂，加入1OmL 6N NaOH中和至微红色。定容：将溶液转移至1OOmL容量瓶（Bl）中，定容。过滤：用滤纸过滤。（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。） 稀释：精确吸取滤液1OmL移入另一个1OOmL容量瓶（B）中，定容。（B）液作为总糖待测液备用。2、标准曲线制作及样品测定取8支25mL刻度试管，按下表所示顺序操作。管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度样品012345In葡萄糖标准液（mL）0.20.40.60.81.0样品待测液（mL）1.01.0蒸馏水（mL）2.01.81.61.41.21.01.01.0DNS试剂(mL)各2.0反应各管混匀，沸水浴5分钟定容冷却；分别用蒸馏水定容至25mL比色以0号管为空白参比，测疋=540nm处的吸光度记录吸光度（A540）六：结果处理:1.由05号管的数据，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A540为纵