感染性疾病实验诊断(2015-7-29)

1、浙江大学医学院附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室传染病诊治国家重点实验室杨杨 青青不充分初始治疗充分初始治疗A post-antibiotic era is instead a very real possibility for the 21st century-WHO感染的诊断感染的诊断 感染类型，感染部位感染类型，感染部位病原体的诊断病原体的诊断 获得确切的病原体获得确切的病原体耐药性的诊断耐药性的诊断 耐药菌的种类耐药菌的种类 耐药机制明确耐药机制明确血清学方法分子生物学方法培养直接镜检法 体外药敏试验 患者男性，患者男性，33岁，岁，有有18年乙肝病史年乙肝

2、病史 6.27患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达患者无明显诱因地出现头痛伴发热，体温最高达38.7度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心度，伴全身肌肉酸痛，乏力，胃纳差，恶心 6.30在杭州某医院就诊，在杭州某医院就诊，血常规血常规：白细白细胞胞 7.410E9/L，淋巴细胞，淋巴细胞3.610E9/L，超敏，超敏CRP 10mg/l，拟诊为拟诊为“脑炎脑炎”，建议患者住院行腰穿，建议患者住院行腰穿，患者拒绝患者拒绝 7.1来我院就诊，头颅来我院就诊，头颅CT未见异常未见异常7.1血培养：血培养：马耳他布鲁菌马耳他布鲁菌发热（发热（ 3838 C C）或低温（）或低温（ 3636 C

3、C）、寒战、呼吸快）、寒战、呼吸快 白细胞增多（计数大于白细胞增多（计数大于1010，000000 10109 9/L/L，特别有，特别有“核左移核左移” 未成熟的或杆状核）、未成熟的或杆状核）、CRPCRP升高升高 皮肤粘膜出血皮肤粘膜出血 血压降低、昏迷、多器官衰竭血压降低、昏迷、多器官衰竭 血 液 病 ： 粒 细 胞 减 少 （ 成 熟 的 多 核 白 细 胞血 液 病 ： 粒 细 胞 减 少 （ 成 熟 的 多 核 白 细 胞1000105CFU/ml，阳性菌104CFU/ml1 1、有无症状、有无症状2 2、是否使用抗菌药物、是否使用抗菌药物3 3、尿是否在膀胱存留、尿是否在膀胱存留

4、3 3h h以上以上4 4、是否为清洁中段尿、是否为清洁中段尿5 5、是否、是否2 2h h之内送检之内送检6 6、导尿袋、导尿袋标本应区分浅表、深部或手术切口标本应区分浅表、深部或手术切口皮肤消毒非常关键皮肤消毒非常关键开放性损伤，开放性损伤，无菌生理盐水擦洗病灶表面无菌生理盐水擦洗病灶表面未溃破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤未溃破的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤取材部位最好为损伤基底部或病变有进展的边缘，取材部位最好为损伤基底部或病变有进展的边缘，不可仅为脓液不可仅为脓液涂片评价标本的质量，快速报告涂片评价标本的质量，快速报告 清洁后金葡菌为主清洁前取样数种凝固酶阴性葡萄球菌 患者女，患者女，5

5、5岁，因岁，因“肾移植术后半年，反复发热一月余，加肾移植术后半年，反复发热一月余，加剧伴关节痛剧伴关节痛6天天”入院。入院。 2月余前，患者因扭伤右脚踝关节，并出现发热，来我院住月余前，患者因扭伤右脚踝关节，并出现发热，来我院住院治疗，体温基本正常后出院。院治疗，体温基本正常后出院。1月余再次出现发热，入院月余再次出现发热，入院后予泰能后予泰能 0.5克克 BID抗感染治疗抗感染治疗5天，体温正常出院。患者天，体温正常出院。患者1月前再次出现发热，体温最高达月前再次出现发热，体温最高达40度，再次住院治疗，予以度，再次住院治疗，予以可乐必妥可乐必妥500mg 静滴抗感染治疗，好转出院。静滴抗感

6、染治疗，好转出院。 6天前，患者天前，患者无明显诱因下，右侧踝关节疼痛再发，伴有高热，体温最高无明显诱因下，右侧踝关节疼痛再发，伴有高热，体温最高达达39，偶有胸闷，偶有胸闷，3.26再次于本院就诊入院再次于本院就诊入院革兰染色：可见有折光性菌体革兰染色：可见有折光性菌体抗酸染色（抗酸染色（4+）快速报告结果快速报告结果敏感性提高敏感性提高取材简便取材简便多以真菌在致病状态产生的物质为检测多以真菌在致病状态产生的物质为检测标标 志物，结果阳性提示有致病性志物，结果阳性提示有致病性定量检测可判断感染严重程度及疗效评定量检测可判断感染严重程度及疗效评估估 乳胶凝集试验： 以乳胶颗粒作为载体的一种间

7、接凝集试验。即吸附新型隐球菌荚膜多糖抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应 胶体金法：阴性阳性 李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度李娟等报道墨汁染色涂片诊断隐球菌脑膜炎灵敏度61.1（11/18),脑脊液真菌培养灵敏度脑脊液真菌培养灵敏度38.9(7/18),隐球菌抗原检测隐球菌抗原检测灵敏度灵敏度100(18/18)，特异度，特异度99.4%(149/150) 刘正印等报道墨汁涂片染色阳性刘正印等报道墨汁涂片染色阳性23例例(23/26,88%)，乳胶凝集，乳胶凝集试验抗原阳性试验抗原阳性20例例(20/20，100%)，培养阳性，培养阳性8例例(8/13,62%) 大多

8、数研究报道灵敏度大多数研究报道灵敏度93100%，特异性，特异性 9398%李娟,吕晓菊,等.四川大学学报（医学版）, 2010, 41(6): 1074-1075, 1079刘正印,王爱霞,等. 中华内科杂志, 2002, 41(8): 541-543 检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖检测底物：曲霉细胞壁成分半乳甘露聚糖(菌丝在组织生长过菌丝在组织生长过程中释放程中释放) 标本：血清、肺泡灌洗液标本：血清、肺泡灌洗液方法：方法：ELISA双抗体夹心法双抗体夹心法 cut-off值：值：ODI 0.5 两次两次ODI 0.5或一次或一次ODI 0.7提高阳性预测值提高阳性预测值GM试验的临

9、床价值血清血清GM推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者推荐用于恶性血液肿瘤患者和造血干细胞移植患者（未进行抗真菌治疗）早期诊断（未进行抗真菌治疗）早期诊断非粒缺、实体器官移植（非粒缺、实体器官移植（SOT）、）、ICU患者、已开始抗真患者、已开始抗真菌治疗，建议同时测定菌治疗，建议同时测定BALF GM半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导半乳甘露聚糖水平的动态变化反应抗真菌药物疗效，指导抗真菌药物使用抗真菌药物使用47假阳性假阳性 哌拉西林哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸克拉维酸 与真菌成分有交叉反应与真菌成分有交叉反应 （组织

10、胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀（组织胞浆菌、皮炎芽生菌、青霉、镰刀霉、头状地霉等）霉、头状地霉等） 谷类食物中的谷类食物中的GM抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患抗原经肠道入血，化疗并且出现严重黏膜炎的患者更容易发生这种吸收者更容易发生这种吸收 检测底物检测底物： (1-3)-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分50%) 标本：血清（无热源采血管），标本：血清（无热源采血管），3h内送检内送检方法：比浊法或比色法方法：比浊法或比色法 cut-off值：不同试剂盒不同值：不同试剂盒不同G试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、试验可检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉、镰刀霉、支顶孢霉、卡氏肺孢

11、子菌，不能检测隐球菌、接合菌卡氏肺孢子菌，不能检测隐球菌、接合菌 G试验的临床价值 目前主要用于侵袭性念珠菌和曲霉感染的诊断、高危人群的监测以及对疗效、预后的评价 对于区分确诊或拟诊侵袭性真菌感染与非侵袭性真菌感染患者，有良好的准确性 连续检测可动态反应真菌感染程度和抗真菌治疗疗效50污染（试管、枪头、蒸馏水）污染（试管、枪头、蒸馏水）血液透析、腹膜透析（纤维素膜透析）血液透析、腹膜透析（纤维素膜透析）外科手术使用纱布外科手术使用纱布抗肿瘤多糖抗肿瘤多糖静脉制剂（白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）静脉制剂（白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）51动态监测WBC 白细胞计数白细胞计数Endotoxin 内

12、毒素内毒素IL-6 白介素白介素-6IL-10 白介素白介素-10TNF 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子Procalcitonin 降钙素原降钙素原CRP C反应蛋白反应蛋白Protein CHMG-1sTREM-1.选择合适血清学指标，帮助临床判断感染的类型、严重程度及疗效费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间费时，对于分枝杆菌、厌氧菌等需要更长时间广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率广谱抗菌药物的使用极大降低了培养的阳性率苛养和少见细菌感染增加苛养和少见细菌感染增加常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无常规的自动化鉴定仪鉴定菌种范围有限，有时无法准确鉴定到种法准确鉴定到种基于基因扩增及

13、测序技术的快速鉴定基于基因扩增及测序技术的快速鉴定蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定蛋白质谱对可培养病原菌的快速鉴定 Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF核酸检测采用核酸检测采用CepheidCepheid公司公司GeneXpertGeneXpert检测检测系统，是一种半巢式实时荧光定量系统，是一种半巢式实时荧光定量PCRPCR体外诊断技术，针体外诊断技术，针对对rpoBrpoB基因基因81bp81bp利福平耐药核心区间（利福平耐药核心区间（RRDRRRDR）设计引物、）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核

14、以及是否对利福平耐药（以及是否对利福平耐药（rpoBrpoB序列存在突变）。序列存在突变）。 可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单HIV患者Tspot 结果阴性GeneXpertGeneXpert检测系统检测系统患者男性，患者男性，72岁，岁，3月前无明显诱因出现咳嗽咳月前无明显诱因出现咳嗽咳痰，检查痰，检查“痰找抗酸杆菌痰找抗酸杆菌+”，“ CT两中肺结两中肺结核核 右下肺、左下

15、肺炎右下肺、左下肺炎”，当地医院诊断，当地医院诊断“肺结核肺结核”，给予给予“异烟肼异烟肼 乙胺丁醇乙胺丁醇 利福平利福平”抗结核治疗抗结核治疗20天后，天后，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，出现药物性肝损，护肝降酶治疗效果不佳，TBIL进行性升高，进行性升高，2011.4.14 “TBIL275.4umol/l”5.16痰找抗酸杆菌抗酸杆菌？抗酸杆菌？结核杆菌？结核杆菌？非结核分支杆菌？非结核分支杆菌？奴卡菌？奴卡菌？痰培养：痰培养：16sRNA PCR 证实证实 为鼻疽奴卡菌为鼻疽奴卡菌痰结核菌培养基因芯片杂交基因芯片杂交 结核分支杆菌阴性结核分支杆菌阴性 鸟分支杆菌阳性鸟分支杆菌阳

16、性对异烟肼（对异烟肼（INH）及吡嗪酰胺（）及吡嗪酰胺（PZA）耐药耐药每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，每周三次给药：克拉霉素或阿奇霉素，利福平、利福平、 乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，乙胺丁醇，加或不加阿米卡星，治疗治疗6个月个月Agns Ferroni et al, JCM, 2010A. Bizzini et al, JCM, 2010基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离-飞行飞行时间质谱法时间质谱法MALDI-TOF MS原理：用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定优势：快速：20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法、纯菌株大约10分钟高特异性和敏感性：接近100%对部分混合感染样本的准确鉴定不足：多报道用于鉴定细菌，酵母菌及分枝杆菌需要建立严格的标准数据库体系进行比对分析 应用范围：纯培养菌株、或报警阳性的血培养瓶检测男男性性，50岁，岁，因因“咳嗽咳痰伴左颊部溃疡咳嗽咳痰伴左颊部溃疡3月月”入院入院病例特点病例特点：3月前患者无明显诱因下出现阵发性咳月前患者无明显诱因下出现阵发性咳嗽咳痰嗽咳痰，继而，继而出现恶心呕吐，伴有乏力出现恶心呕吐，伴有乏力当地当地CT：两肺多发感染，两肺多发性弥漫粟粒及两