Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性

1、Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性    【关键词】  Livin基因; 非小细胞肺癌; 分子生物学 原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程当中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of

2、 apoptosis protein，IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织中特异性表达。目前的研究表明， Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点1-3。本文就Livin基因在NSCLC中的表达及

3、其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。     1  Livin基因及蛋白结构功能的多样性     IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一个环指结构域(RING finger domain，RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP,XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)

4、，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(ML?IAP/KIAP)2。     Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等3在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等4从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP（kidney inhibitor of apoptosi

5、s protein，KIAP）。Vucic等5发现Livin基因在G361 和 SK?Mel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等6发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为Livin 和Livin 。 同时，Lin等4用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2,2.8和4.0 kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个螺旋和一个三股抗平行 片层，与相应

6、的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构4,6，氨基酸残基C124,C127,H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。         Livin蛋白有和两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5端54 bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等3认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 C末端的R

7、ING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。     2  Livin基因在NSCLC中的表达    

8、Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义2,7。Tanabe等7采用 RT?PCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现Livin mRNA在NSCLC组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。Crnkovic?Mertens 等1,8同时采用NSCLC组织和NSCLC源 HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livin 和Livin 的表达，结果

9、显示Livin 和Livin 在NSCLC中呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin 和Livin 基因的功能意义不完全相同， Livin 在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等9采用RT?PCR法检测NSCLC组织中Livin mRNA和Livin  mRNA的表达，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为71.1，两种异构体基本同时表达，Livin mRNA的表达量略高于Livin mRNA。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7和6.7。而且Livin

10、mRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等10采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为45.5?和50.0?，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为72.7?和11.1?,两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等11 的研究结果显示，48例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳

11、性率为22.9%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中Livin mRNA表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin 蛋白表达与mRNA表达相一致。研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。         目前，Livin基因在NSCLC组织中特异性地高表达的现象已引起许多学者的关注1，但Livin

12、 mRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。     3  Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制     Kasof等3,8研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase?3,7,9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD（Fasassociate

13、d protein with death domain）,Bax,RIP,RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等13将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas,TNFR?1（tumor necrosis factor receptor? 1）,DR4（death receptor 4）及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livin 和Livin 蛋白的抗细胞凋亡作用

14、存在一定差异。Yang等14,15观察在Jurkat T淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNF及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl 2。Livin 对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin 则无此作用。Crnkovic?Mertens 等8 采用RNA干扰技术分别使内源性Livin 和Livin 基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin 可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（UV irradiation）等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livin 则不明显。更多的研究则认为Livin 和Livin 基因均具有抗

15、细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。     许多研究证实12-16，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase 3和Caspase 7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase 9结合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating  factor 1）、细胞色素C及dATP诱导的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livi

16、n蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna 等12的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNF和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是MAP3激酶之一，在

17、TGF1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic 等13证实SMAC（ second mitochondrial activator of caspases, SMAC）及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。   

18、0;     4  Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景     鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livin 和Livin 的NSCLC A549细胞克隆。孙建国等17用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livin 和Livin 基因后的细胞尤其是表达Livin

19、的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 Gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。      Crnkovic?Mertens等18利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA)技术，在肺癌SPC?A1细胞株中建立Livin异构体和特异的基因沉默体系，观察诱导SPC?A1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livin 和Livin 基因沉默后，SPC?A1细胞克隆

20、形成能力较对照组显著下降，促使SPC?A1细胞发生凋亡，表明Livin 和Livin 两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。     由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等19用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等20  用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLA?A24与Livin 7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的N

21、SCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs），而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点21，22。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（a

22、ntisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（small?molecule inhibitors）和免疫介入（immune?mediated approaches）等基因治疗手段直接阻断Livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径23，24。同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白（受体）及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。      【参考文献】  1 Crnkovic?Mertens I, Mu

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