DNA指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用

1、 中国标准化200117DNA (脱氧核糖核酸 是细胞染色体中的遗传基因, 其分子各个片段就代表各个遗传信息。由于DNA 指纹图谱直接反映DNA 水平量是相对而言的, 在一些作物上RF LP 探针可进行品种间及种间的条件的影响很大, 在小麦等较大基因组作物的研究中重复性低, 严重影响实验结果的可靠性。3. 小卫星DNA 方法鉴别, 而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。特别是小麦, 它是严格的自花授粉作物, 基因组较大, 多态性很低(即使在相当分散的品种间也是如此 。因而, RF LP 方法在指纹图谱中的应用受上的差异, 它成为当今最先进的遗传标记系统。DNA 指纹图谱技术主要有:限制性

2、片段长度多态性(Restriction fragment length polym or 2phism , 简称RF LP 、随机扩增多态小卫星DNA 方法是19801984年间由人类遗传学家相继在人体基因组中发现的。它是由长度为1160bp 的核心序列串联重复形成的可达25K b 的串联重复序列, 主要存在于染色体的近端粒处, 在不同个体之间存在着串联数目的差异, 因而可产生多态性。多态性的产生, 可能是在DNA 复制或不等交换过程中发生的串联数目的变化引起的(Jeffereys ,1985年 。小卫星DNA 在真核基因组中具有多等位性、高丰富性和极强的保守性。Jeffereys 等人198

3、5年发现人源小卫星探针可以同时与众多的基因组DNA 酶切片段杂交, 得到具有个体特异性的指纹图谱。目前, 已发现了一些十分有用的小卫星探针。Vassart1987年发现M13噬菌体可以识别人、动物、植物的品种间多态性。Liu 等人1992年在小麦基因组文库中筛选到的pT ag546能到限制。21RAPD 方法RAPD 方法是Willams 等人于1990年发明的。它是利用扩增DNA 片段长度差异来检测生物个性(Random am plified polym orphic DNA , 简称RAPD 、小卫星DNA (Mini 2satellite DNA 、微卫星DNA (Microsatell

4、ite DNA 、内部简单重复序列(ISSR 、扩增片段长度多态性(Am plified fragment length polym or 2phism , 简称AF LP 等等。体的分子标记技术。它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下, 对其进行基因组指纹图谱的构建。其相对于RF LP 方法较简便,DNA 用量也较少, 且省去了使用放射性同位素, 受到了许多学者的重视。Welth 1991年曾用RAPD 分析玉米杂交种的品种纯度,He 等人1992年曾用RAPD 识别小麦品种, 在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。但RAPD 是显性标记, 不能区分杂合型和纯合型, 更重要的是,

5、RAPD 检测受反应一、DNA 指纹图谱的方法11RF LP 方法RF LP 方法是G rodzicker 等人于1974年发明的。它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。RF LP 方法于上个世纪80年代开始应用于植物, 在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。但RF LP 的多态信息含中国标准化200117区分出全部参试的56个普通小麦 品种, 是绘制小麦指纹图谱非常有用的探针。41微卫星DNA 方法过选择性扩增基因组DNA 的酶切片段而产生多态性, 选择性扩增是通过在引物的3末端加上选择性核苷酸而实现的。通过改变选择性核苷酸的数目, 就可

6、预先决定所要扩增的片段的数目。AF LP 方法可以分析基因组100150个扩增物。AF 种及育种家的权益。因此, 作物品种的鉴别技术需具备4个基本准则:即环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异及实验结果的可靠性。在品种的鉴别上, 随着育种进程的加快, 作物, 仅就小麦而言, 其1万余种以上, 这对品了更高的要求。指纹图谱技术, 不仅完全符合作用品种鉴别中的4个基本准则, 而且在相对于早期的形学标记, 又具有简便、迅速等优点。因而, 是作物品种评价鉴定中较好的遗传标记。在我国建立主要作物品种的标准指纹图谱, 对保护我国名、优、特种质及育成品种的知识产权和育种家们的权益均有重要意义。

7、21品种纯度和真实性检验微卫星DNA 方法(又称Sim ple sequence repeat , 简称SSR 是一类由几个核苷酸(一般为15 为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。同一类的微卫星可分布于整个基因组的不同位置上。全相同, 造成每个座多性。这种多态性的信息量是比较高的。由于每个微卫星DNA 两端的序列多是相对保守的单拷贝序列, 可根据其两端的序列设计一对特异的引物, 通过扩增而产生多态性。微卫星DNA 具有所有RF LP 的遗传学优点, 且避免了RF LP 方法中使用放射性同位素的缺点, 又比RAPD 重复率和可信度高, 因而成了遗传标记中的热点。微卫星DNA 已应用于

8、蕃茄、大豆、水稻、玉南芥、大豆、水稻、棉花等作物上。研究表明,AF LP 产生的多态性远远超过了RF LP 、RAPD 等技术, 被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。由于AF LP 已申请专利, 在生产及商业上的应用受到了限制。61ISSR 方法ISSR 方法创建于1994年, 是在PCR 技术基础上发展起来的一种检测方法, 它继承了PCR 技术的高效率、DNA 样品用量少、特异性强和检测方便等优点, 更比RAPD 技术有明确的针对性, 因为其扩增位点是基因组内的微卫星DNA 。同时, 由于PCR 扩增条件中的退火温度较高(一般为50度左右 , 其稳定性和重复性也好于RAPD 技术。

9、与SSR 相比,ISSR 标记无需预先知道微卫星的侧翼顺序, 且一次扩增的位点在38个左右或更多, 多态检出率高, 信息量明显高于SSR 。但ISSR 与RAPD 相似, 不能提供检测位点的纯合与杂合状态。许多原因可能导致作物品种、品系或自交系的杂化, 即遗传变异的增加, 对此需要进行有效的监测。在育种上, 也需要知道新育成的品种品系的遗传纯度。遗传纯度的测定需要对基因组具有代表性的遗传标记, 指纹图谱由于其高度的个体特异性, 甚至可以监测到基因组中一些微小的变异, 因而是十分理想的遗传纯度的检测技术。在种子生产和贸易中, 对种子质量最主要的要求之一, 就是种子的纯度和真实性。种子公司检测种子

10、纯度和真实性的传统方法是生长测验, 就是把有代表性的种子播种, 通过成株的表型来判断真伪及纯度。这种检测方法费工、费时, 且检测结果易出偏差。指纹图谱简便、快速、准确等特点, 远远优于传统的生长测验。采用指纹图谱技术, 建立一套主要作物的标准指纹图谱, 对于防止伪劣种子流入市场, 提高种子市场的种子质量, 意义十分重大。米、芸薹属和拟南芥属等许多作物中。通过对微卫星DNA 序列的研究, 相应产生了使用人工合成的寡核苷酸作探针的方法, 这种方法也可检测到大量的多态性。微卫星DNA 是目前极受欢迎的指纹图谱技术, 但这种方法必须针对每个染色体座位的微卫星, 发现其两端的单拷贝序列才能设计引物, 这

11、给微卫星标记的开发带来一定的困难。这项技术在商业上还没有完全应用, 仅发现了一些有用的SSR 引物, 其巨大的利用价值等待研究者的开发。5. AF LP 方法AF LP 技术是1992年荷兰K ey 2gene 公司发明的。AF LP 以PCR 为二、DNA 指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用11新品种登记和品种鉴定新品种审定前, 需要确定该品种的遗传特性、一致性和稳定性, 找到该品种区别其他已有品种的特征, 在新品种登记时, 作为该品种的专有“代号”, 保护新育成的品基础, 实际上是RF LP 和PCR 相结合的一种方法。其基本原理是通中国标准化20011731品种的亲缘关系和分类研时还会因品

12、种的发明权而发生争议; 同时由于基因工程的发展, 生物工程专家可对一个优良品种进行极小的改变(如改变一个基因 。那么, 被改变的品种又可能以一个新的面貌出现, 若这种改变不是表型可见的, 传统差别方法对差别新品种就无能为力调, , 众不同。针对以上问题, 分子标记可作为判别植物新品种的新手段。因为分子标记的指纹图是根据每个品种的DNA 组成, 用可见的条码式的谱带图谱进行检测的一种方法。它提供的证据是新品种的基因型, 是稳定的DNA 带谱, 不受栽培条件影响, 并可通过计算机进行系统管理。如对某作物新品种作出的DNA 指纹图谱等信息, 通过输入计算机与其他品种进行比较, 鉴定其在DNA 水平的

13、异同和特点, 以达到认定和保护的目的。21分析和检验种子纯度, 尤其由于其为基因表达加工后产物, 仅是DNA 全部多态性的一部分, 而且其特异性易受环境条件和发育阶段的影响, 这对遗传变异的检测就远不及分子标记分析得快速、准确、可靠。分子标记可从植物体任DNA , 尤其是从幼苗或DNA 进行种苗品质的, 克服了其他遗传标记随环境条件或组织发育阶段而异的缺陷。同时, 其可供检测的DNA 标记的数量从理论上是无限究根据各品种指纹图谱的差异程度可以判断品种间亲缘关系的远近, 测量品种间的遗传距离, 进行系谱分析。Halward 1992年利用10个RAPD 随机引物对花生的29个野生种基因组分别进行

14、了检测, 并根据10个引物在29个野生种基因组扩增产物DNA 条带的统计, 利用计算机对这些数据进行分析, 建立了这29明, 利用RAPD 获得的29个花生野生种的分类与经典方法得到的结果基本一致。确定亲本间的亲缘关系并据此对其进行分类, 对科学地配制杂交组合等方面具有重要作用。如玉米传统鉴定自交系的方法是靠配制大量的杂交组合, 根据F1的表现来评价自交系和确定杂交组合, 十分繁琐, 而利用指纹图谱技术就可以简便、快速、准确地鉴定自交系, 指导配制杂交组合。目前, 蛋白质指纹图谱在国际上已较广泛应用, 而在国内只有一些初步的研究;DNA 指纹图谱在国际上也只是刚刚起步, 国内在这方面的报道极少

15、。因此, 迅速开展我国主要作物品种指纹图谱的研究工作, 建立我国主要作物品种指纹图谱数据库, 是十分必要和切实可行的。的, 这是形态、细胞、生化等遗传标记所无法比拟的, 从而, 为进行各种物种多态性分析和种子纯度鉴定, 奠定了坚实、可靠、稳定的基础。四、DNA 指纹图谱在应用中存在的问题和要解决的关键环节DNA 指纹图谱虽然在植物系统学研究中得到广泛应用, 但大多数的研究仍停留在实验室阶段, 以及探索性地进行辅助育种工作, 将这一技术用于大规模的辅助育种和种子鉴定还需一定的过程。而最重要的是要解决两个方面的关键技术:一是确立高效、准确、经济、简便的基因检测系统, 包括基因鉴定、标记及作图技术; 二是广泛挖掘、鉴定、利用与作物高产、优质、抗病虫、抗逆性有关的新基因, 进行各种基因的标记和定位。毋庸置疑, 在不久的将来, 随着我国科学技术的发展, 该技术必将广泛应用于农业科研、生产等方面, 为我国农业的发展发挥重大的作用。(作者单位:国家农业标准化监测是杂交品种的纯度鉴定随着一些重要的农作物, 如玉米、水稻、油菜、大白菜、西红柿、向日葵等, 已在生产中推广了杂交种, 为了保证种植者的利益, 种子纯度测验已成