脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性

1、脱镁叶绿酸的制备及其光敏抗菌活性                             作者：唐蕾 徐磊 韩跃 毛洪 【摘要】  以初步纯化的叶绿素为原料，利用叶绿素酶水解、选择性酸降解两种方法制备脱镁叶绿酸。高效液相色谱分析显示两种方法得到的产物图谱相似，酸降解产物中脱镁叶绿酸A的含量较高。抗菌

2、实验表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌具有光敏抑菌效果，对革兰阴性菌和酵母无明显作用。 【关键词】  脱镁叶绿酸； 叶绿素酶； 高效液相色谱； 光敏抗菌活性    ABSTRACT  Partially purified chlorophyll was used to prepare pheophorbide (Pheide) by chlorophyllase hydrolysis and selective acidic hydrolysis methods. High performance liquid chromatography analy

3、sis showed that the Pheide A was obtained with higher purity by acidic hydrolysis method. The antimicrobial test showed that Pheide had obvious photosensitive activity against Gram positive bacteria.    KEY WORDS  Pheophorbide;  Chlorophyllase;  High performance liquid

4、chromatography;  Photosensitive antimicrobial activity   光敏剂是一些具有光活性的化合物，可以选择性地富集在特定的组织，在紫外或可见光的激发下，产生光动力杀伤作用，起到杀菌和治疗肿瘤的功效。近年来，由于抗生素的滥用所引起的毒副作用、耐药菌的出现和自然微生物群落的破坏，使得天然、环境友好、能够有效地杀灭有害菌而不伤及邻近组织的光敏剂颇受关注1。论文学术科研网脱镁叶绿酸(Pheide)作为卟啉类光敏活性剂具有结构明确、稳定，在红外区有较强的吸收，光敏活性更有效等特点，在癌症的光敏动力学治疗中已有报道24，但其光敏

5、杀菌作用尚待探讨。此外，脱镁叶绿酸作为叶绿素(Chl)的中间降解产物在植物中很少积累，分离困难，但可以通过叶绿素的酶促水解和酸降解法获得5，6。基于上述分析，本文对酶法和酸法叶绿素降解产物进行了比较，并研究了其对细菌和酵母的光敏活性。    1  材料与方法    1.1  菌种    酵母  八孢裂殖酵母(Schizosaccaromyces octos?porus)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsberg

6、ensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黏红酵母(Rhodotorula glutins)、隐球酵母(Cryptococcus sp.)。    细菌  产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)、金葡菌(Staphylococcus aureus)、四联球菌(Micrococcus tetraglnus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcus albus)、大肠埃希菌(Escheric

7、hia coli)。均为实验室保藏菌种。    1.2  培养基及培养条件    酵母培养基  酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000ml，pH6.0。    细菌培养基  NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，定容至1000ml，pH7.0。121灭菌20min。    培养温度  酵母28，细菌37，光照为培养箱内置光源。    1.3  抗菌实验  &

8、#160; (1)在固体平板上均匀涂布200l菌液，取10l待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴于已接菌的琼脂培养基表面，光照条件下恒温培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药物(细菌为氨苄西林，酵母为放线菌酮)相比较，每个处理设3个重复。    (2)将待测菌在含有50g/ml的Pheide培养基上十字划线，比较光、暗条件对微生物生长的影响，每个处理设3个重复。    1.4  叶绿素的提取    参照Iriyama法7，从菠菜中提取和纯化叶绿素，丙酮溶解，测定溶液在645和6

9、63nm处的吸光值，按照Arnon公式计算叶绿素含量：    Chl A(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645    Chl B(mg/ml)=0.0229A645-0.00468A663    1.5  脱镁叶绿酸的制备    (1)酶解法  采集新鲜的豌豆叶，洗净晾干，在冷丙酮中匀浆后过滤，滤物用冷丙酮漂洗并干燥。1g过滤物用25mL磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.0，内含0.24% TritonX?100)搅拌抽提4.5h

10、，在8000r/min，4条件下离心10min，上清液即为所需叶绿素酶酶液。叶绿素酶酶液中蛋白含量的测定采用双缩脲法。叶绿素酶溶液、20mmol/L磷酸缓冲液和0.15mg/ml叶绿素充分混匀(该反应体系中蛋白质终浓度为3.2g/l、丙酮40%、TritonX?100 0.60%，pH7.0)，在37恒温水浴中12h反应完全后，加入正己烷丙酮10mmol/L KOH(321)涡漩混匀，在8000r/min，4的条件下离心10min。取下层并加入几滴盐酸酸化即得到脱镁叶绿酸溶液，4冰箱避光保存。    (2)酸解法  采用Hynninen选择性酸法水解6，

11、盐酸?惨颐逊旨斗掷耄?将醚层中的溶剂挥发，得到的脱镁叶绿酸溶于丙酮中，4冰箱避光保存。    1.6  高效液相色谱条件    色谱柱为Eclipse×DB?C18(150mm×3.0mm，5m)；流动相为95%甲醇溶液(色谱纯)；流速0.8ml/min；检测波长430nm。学术科研网    2  结果与讨论    2.1  脱镁叶绿酸的制备    脱镁叶绿酸作为天然卟啉是叶绿素降解的中间产物，在

12、茶叶、柑橘、老化叶中普遍存在，但含量低，分离困难。一般通过叶绿素酶催化，植醇基水解，得到脱植醇叶绿素，继而酸化得到脱镁脱植醇叶绿酸即Pheide(图1)。    由于疏水性植醇基的去除，Pheide的亲水性大大增加，可以通过液液分离将底物Chl与产物Pheide分离。由于Chl A和Chl B同时可以作为叶绿素酶的底物，因而产物中除Pheide A外还常含有少量的Pheide B。Hynninen等6根据Chl A、B植醇基水解能力的不同，开发了直接从Chl A、B混合物通过选择性酸降解制备Pheide A的方法。图2为菠菜色素的粗提液，经过Iriyama法纯化得

13、到Chl A、B，和选择性酸降解产物的薄层层析结果。得到的产物条带经质谱分析显示分子量为592与Pheide A一致。高效液相色谱是检测叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等色素的常用分析手段，本研究用反相高效液相色谱，选择叶绿素和类胡萝卜素的检测波长430nm比较两种制备方法，图谱显示两者的结果相似，其中选择性酸降解的纯度较高(图3)。    2.2  脱镁叶绿酸抗菌实验    我们首先选择实验室保存的5种细菌和6种酵母进行了光敏抑菌实验，结果表明脱镁叶绿酸对革兰阳性菌有明显的抑菌作用，但对革兰阴性菌和酵母没有抑制作用(表1)。为了

14、进一步验证该结果，以多种细菌(产气肠杆菌、金葡菌、四联球菌、北京棒杆菌、枯草芽孢杆菌、白葡萄球菌、大肠埃希菌)为对象，比较了光照和黑暗培养条件下细菌的生长情况，发现光照显著抑制了革兰阳性菌的生长(图略)。该结果与其它卟啉类化合物所得的结果一致810。制备方法(酸法和酶法降解)对所得的结果没有显著影响。    3  结论    天然光敏抗菌剂在解决抗生素的毒副作用和抗生素耐药性、选择性杀灭有害菌和保护自然微生物群落方面具有优势。叶绿素来源广泛，其卟啉降解产物在植物中普遍存在，安全、可靠，是天然光敏剂的良好候选者。本文的研究表明

15、，采用酶法和酸法均可得到以脱镁叶绿酸为主的产物，该产物对包括金葡菌在内的革兰阳性病原微生物具有光敏抑菌作用，对酿酒酵母等酵母无抑制作用。【参考文献】  1 唐蕾，诸葛健. 天然光敏剂的光动力抗菌作用J. 中国抗生素杂志，2004，29(11)：704706.2 Wongsinkongman P, Brossi A, Wang H. Antitumor Agents. Part 209: Pheophorbide?a Derivatives as Photo?Independent Cytotoxic Agents J. Bioorgan Med Chem,2002,10(3):583

16、591.3 Jonker J W, Buitelaar M, Wagenaar E, et al. The breast cancer resistance protein protects against a major chlorophyll?derived dietary phototoxin and protoporphyria J. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(24):1564915654.4 田华，黄锁义，郝振文. 卟啉类抗癌药物的研究进展J. 化学研究，2004，15(3)：6367.5 Almela L, Fernández?L

17、43;pez J A, Roca M J. High performance liquid chromatographic screening of chlorophyll derivatives produced during fruit storage J. J Chromatogr A,2000,870(12):483489.6 Hynninen P, Lotjonen S. Preparation of phorbin derivatives from a chlorophyll mixture utilizing the principle of selective hydrolys

18、is J. Synthesis,1980,7:539541.7 Iriyama K, Ogura N, Takamiya A. A simple method for extraction and partial purification of chlorophyll from plant material using dioxane J. J Biochem,1974,76(4):901904.8 唐蕾，曹建平，吴亢，等. 叶绿酸酯的光敏杀菌作用J. 无锡轻工大学学报，2004，23(2)：5861.9 Gábor F, Szocs K, Maillard P, et al. Pho