植物生物技术概论(南农)

1、南京农业大学植物生物技术概论阐述基因工程的原理和科学意义基因工程原理：对不同生物的遗传物质基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内，进行复制、转录、翻译表达的操作，使所需要的基因在细胞中表达产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。科学意义：1.不受亲缘关系的限制，可实现动物、植物和微生物间遗传物质的交流，从而充分利用自然界存在的工作遗传物质2.加快育种进程，缩短了进化时间。3.使人能对生物体进行定向构造。4.有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因。基因工程的四大要素：目的基因、工具酶、载体、受体。1

2、973年 基因工程诞生的元年理论上的三大发现：（1）首先，40年代发现了生物的遗传物质是DNA。 （2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。技术上的三大发明：(1)限制性核酸内切酶的发现、 DNA连接酶的发现(2)基因工程载体的发现(3)逆转录酶的发现 基因工程研究内容应包括以下几个主要步骤：（1）从现有的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，获得带有目的基因的DNA片段。（切）（2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有选择标记的载体分子

3、上，形成能够自主复制的重组DNA分子。（连）（3）将重组DNA分子转移到适宜的受体细胞，并使其一起增殖。（转）（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。（选）（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。（扩）（6）将分离到的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质 。（表）相关概念结构基因(structural gene)是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋白质和酶

4、。从广义上讲，任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因(regulatory gene)，一般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。 首先转录成mRNA，然后由mRNA翻译成阻遏蛋白质或激活蛋白质，通常也称为转录因子或反式作用因子。它们通常结合到结构基因的非编码区的顺式元件上起调控作用。管家基因和奢侈基因: 具有相同遗传信息的个体细胞间其所利用的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的，而有的基因则在一些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。前者称为管家基因(house-keeping gene)，如编码核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等的基

5、因；而后者被称为奢侈基因(1uxury gene)移动基因 插入序列(IS)的转座因子。直至1980年夏皮罗(Shapiro)等人证实了可移位的遗传基因存在，说明某些基因具有移动性。转座子也称易位子，是由两个重复顺序夹着一个或多个结构基因组成。有的转座子的重复序列就是IS。转座子也和IS一样，能从一个位点转座到另一个位点，或从一个复制子转座到另一个复制子。转座子属于可移动的遗传因子移动基因。除了转座因子外，病毒和质粒都是染色体外的可以移动的遗传物质，都必须依赖宿主而复制。假基因 是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。假基因DNA顺序

6、可在相应基因名称之前加表示。假基因的五个显著特点：基因的结构发生突变、没有内含子、具有与mRNA的poly(A)尾的相应结构、两侧有顺向重复序列、随机出现在非正常的位置上。植物组织培养在农业上的应用 1、快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物2、植物脱毒3、植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植物4、通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限5、胚胎培养的应用 在远源杂交中，杂交后形成的胚珠往往在未成熟状态时，就停止生长，不能形成有生活力的种子，因而杂交不孕，这给远缘杂交造成极大困难。远缘杂交中，由于生理上和遗传上的障碍而不能杂交成功，可采用试管受精加以克服，即将母本胚珠离体培养，使异种

7、花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株。6、细胞融合 通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种货育成优良品种。7、培养细胞突变体的应用 培养细胞处在不断分生状态，它就容易受培养条件和外加压力（如射线、化学物质）的影响而产生诱变，从中可以筛选出有用的突变体，从而育成新品种。8、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等9、利用组织培养的材料作为植物生物反应器10、用于其它未知科学的研究a谈谈现阶段转基因生物技术的应用及安全性1、基因工程在生物学研究领域得到广泛应用基因工程属于分子生物学的一个分支或是一个生长点，分

8、子生物学的理论与技术是基因工程的基础。现在人们广泛应用DNA重组、定点突变、核酸杂交、序列分析、反义抑制、基因敲除等技术，直接从生物样品的基因入手，通过解析蛋白质的结构和功能，进而阐明复杂的生命表征。2、基因工程在医药领域中的应用A、基因诊断（1）基因诊断(gene diagnosis)又称为DNA诊断，是利用重组DNA技术，直接从DNA水平来检测人类遗传性疾病中的基因缺陷，从而作出判断。（2）基因诊断的特点：a.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。b.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。c.分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度很高。d.适

9、用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外源基因。（3）基因诊断的基本技术与常用方法：a.DNA点杂交。b.限制性内切酶图谱直接分析法。c.限制性片段长度多态(RFLP)分析。d.寡聚核苷酸探针杂交分析法。B、基因治疗（1）基因治疗：是用正常的基因整合入细胞，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。（2）基因治疗所采用的方法：a.基因矫正基因置换就是用正常基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。b.基因增补：基因增补指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得

10、到加强。目前基因治疗多采用此种方式。c.基因失活：早期一般是指反义核酸技术。它是将特定的反义核酸，包括反义 RNA，反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又有反基因策略、肽核酸、基因去除和RNA干扰技术。C、基因工程药物研究 基因工程药物开发的重点从大分子蛋白质药物转移到寻找较小分子的蛋白质药物。使其容易穿过细胞膜，发挥其药理作用。广义地说，凡是在药物生产过程中涉及用基因工程的，都可以称为基因工程药物。另一方面，对疾病的治疗思路也开阔了，从单纯用药物发展到用基因工程技术或基因本身作为治疗手段。 3、基因工程在农业上的应用：A、增加农作物产品的营养价值。如：增加

11、种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等。B、提高农作物抗逆性能。C、提高光合作用效率。D、生物固氮的基因工程，减少氮肥使用。E.增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% F.建立雄性不育系。将RNase基因与植物花药绒毡层特异表达启动子连接，导入植物后能导致植物雄性不育。4、基因工程在工业上的应用A酶工业：生产各种蛋白酶用于洗涤剂、淀粉加工、糖果及乳品、饮料、乙醇、造纸。B微生物工业：医药生产、氨基酸生产、乙醇发酵(纤维素酶）、食品（鸡的卵清蛋白酵母菌）C代谢工程工业：生化途径生产次生代谢产物D基因工程菌可加速分解原油生产中的蜡。安全性A、转基因生

12、物与食物安全。1、反对“实质性等同”。这里所说的实质性等同原则是指转基因生物与自然存在的传统生物在相同条件下进行性状表现的比较。比较的内容包括生理性状、分子特性、营养成分、毒素含量和过敏源等是否有等同性。如果实质上是相同的，就应该将转基因生物与传统生物同样对待，视为安全。2、安全性检测问题。反对者认为，对食品安全性的检测不仅要检测其主要成分是否发生改变，还应包括其他方面的检测结果。比如人使用转基因食物后机体的代谢指标等；3、担心出现滞后效应。他们担心转基因植物的DNA经过重组后，可能合成毒性蛋白，或者某些蛋白质会影响人的免疫系统，对人造成危害。这种影响可能要若干年或一两代之后才显现出来；4、担

13、心出原现新的过敏原。转基因生物合成的某些新的蛋白质，可能成为过敏人群的过敏原；5、担心营养成分的改变。因为DNA发生了重组之后，他们担心有些基因会使植物体内某些代谢途径发生改变，可能会导致转基因作物的营养成分改变。B、转基因生物是否会对生物多样性构成威胁。 1、转基因植物可能会扩散到种植区以外，破坏了这一区域生态平衡后，成为杂草；2、转基因生物可能成为“入侵的外来物种”威胁生态系统其他生物的生存。因为科学家赋予了转基因生物某些特殊性状，增强了它们的竞争能力；3、外源基因可能与感染转基因生物的某些细菌获病毒杂交，重组出对人类或其他生物有害的病原体。因为病毒在宿主细胞中装配时，有可能也将

14、宿主细胞的DNA组装进去，这样外源基因就可能与病毒基因重组；4、有可能使杂草成为除不掉的“超级杂草”。转基因植物的抗除草剂基因可能通过花粉传播进入杂草，使杂草也获得了抗除草剂的特性。 C、转基因生物是否对生态系统的稳定性和环境造成破坏。b植物遗传转化方法？间接转化法农杆菌介导转化法 直接转化法：A、 基因枪转化法：将包被在微小的金属微粒（钨或金粒）表面，通过高压驱动力的加速微粒穿透植物细胞壁，导入受体组织细胞内，然后通过组培再生出完整的植株，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到染色体上并得到表达。B、 电击法：将原生质体在溶液中与DNA混合，然后利用高压电脉冲作用，使原生质体膜的某些

15、部位被击穿而产生可回复的小孔，外源DNA可通过小孔进入原生质体内，且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力。C、 花粉管通道法：利用开花植物授粉后形成花粉管通道，直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。D、 PEG介导基因转化法：在聚乙二醇PEG、多聚-L-鸟核苷酸pLO、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 PEG可促进细胞膜与DNA间接接触与粘连，并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别，利用细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体。直接和间接转化方法的优缺点：间接：优点：受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器

16、官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；缺点：转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了其在禾谷类作物上的应用。 转化体常出现“嵌合” 现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞。直接：优点：无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单 缺点：转化效率低，需要专门的设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法）举例两种鉴定外源基因整合进植物基因组的方法转化体的筛选：1 为有效地选择出真正的转化细胞，必须使用特异性的选择标记基因进行标记。常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因两大类，如

17、卡那霉素抗性基因NPT和潮霉素抗性基因hpt，除草剂抗性基因bar基因等。除了上述选择基因外，2 还有报告（标记）基因，主要包括农杆碱合成酶类（章鱼碱合酶基因Ocs、胭脂碱合酶基因Nos；抗生素转化酶类（新霉素磷酸转移酶基因NPT）;自身有光学活性的非酶蛋白类（绿色荧光蛋白GFP）；产物具有光学性质的酶类（葡糖醛酸酶基因GUS）转化体的鉴定：1、DNA水平的鉴定 DNA水平的鉴定主要是检测外源目的基因是否整合进入受体基因组，整合的拷贝数以及整合的位置，常用的检测方法主要有特异性PCR检测和Southern杂交。2、转录水平的鉴定 3、基因表达产物蛋白质水平检测载体 （Vectors）广义上通常

18、把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。基因工程对载体的要求1、 具有自身的复制子，能独立复制；2、 具有多个限制酶识别稳点（多克隆位点）；3、 具有筛选标记或遗传表型；4、 具有足够的容量，能够插入的外源DNA片段的大小；5、 表达性载体还应该具备与宿主细胞相适应的启动子、签到序列、增强子等调控原件；6、 载体均含有一段非必须区，将外源基因插入该区后，载体本身不受影响。【（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或

19、稳定遗传。（3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害】载体的种类来源：质粒（plasmid）、 单链DNA噬菌体M13 、 l噬菌体的衍生物 、 柯斯质粒（cosmid） 、动物病毒（virus）。（M13单链DNA载体：具有多种适用的限制性酶切位点，有利于外源DNA片段的插入组装；带有Lac Z基因，便于在X-gal选择性平板上筛选；插入在M13载体的基因还可以直接进行DNA序列分析，易于在较短时间内确定突变位

20、点。）功能：1克隆载体: 克隆一个基因或DNA片段；2表达载体: 用于一个基因的蛋白表达；3整合载体: 把一个基因插入到染色体组中。农杆菌转化相关：程序：植物材料 农杆菌 预培养 激活培养（离心、重悬） 共培养 恢复培养（含抗菌素） 筛选培养（施加选择压） 转基因植株 检测影响农杆菌转化效率的因素： 适宜的1、受体基因型 2、农杆菌菌系3、表达载体 4、共培养技术 5、筛选和再生体系农杆菌介导法的 优点： 1、转化效率高 2、所转DNA明确（T-DNA左右边界之间） 3、插入基因多为单拷贝整合 4、导入基因易于表达 5、可转移较大片段DNA 6、操作简单 7、成本低 缺点：1、宿主范围的限制

21、2、基因型特异性 3、再生细胞感受态与转化细胞感受态的不一致性 4、农杆菌导致检测结果的假阳性植株水平 农杆菌转化技术：1、农杆菌浸花转化 2、农杆菌注射未成熟籽粒转化 3、农杆菌茎尖生长点转化举例几种遗传标记类型，举例2种遗传标记的技术原理，举例遗传标记的应用。遗传标记：可遗传性，可识别性（多态性）：指基因组中任何座位上的相对差异或是DNA序列的差异。作用：可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律，用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。类型：1、形态标记：指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。广义的还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生

22、理特性、生殖特性、抗病虫性等。 优：简单直观、方便经济、容易观察记载 缺：数量少，难以建立饱和的遗传图谱，利用有一定的限制。2、细胞学标记：能明确显示遗传多态性的细胞学特征。 缺点：鉴定困难，数目有限，难以开展精细定位。3、生化标记：主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。 缺点：标记的数量有限，不能满足基因定位、克隆的要求； 每一种同工酶标记都需要特殊的显色方式和技术； 某些酶的活性具有发育和组织的特异性。4、分子标记：指在分子水平上的可标识的遗传多态性（基因组中任何位点上的相对差异） DNA标记，指可标识核苷酸序列的多态性（单核苷酸突变、插入/缺失

23、） 原理：酶切位点（或PCR引物结合位点）突变 酶切位点（或PCR引物结合位点）之间的插入突变 酶切位点（或PCR引物结合位点）的缺失突变 酶切位点（或PCR引物结合位点）之间的串联重复单元数量改变 单核苷酸突变。理想的DNA标记应具备以下特点：（1）遗传多态性高；（2）共显性遗传，信息完整；（3）在基因组中大量存在且分布均匀；（4）选择中性；（5）稳定性、重现性好；（6）信息量大，分析效率高；（7）检测手段简单快捷，易于实现自动化；（8）开发成本和使用成本低。分子标记的类型：基于DNA-DNA杂交的DNA标记(RFLP)。该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，

24、然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是发现最早和应用广泛的RFLP标记。  程序：1基因组DNA的制备 2限制性内切酶消化 3碱变性 4琼脂糖凝胶电泳 5转膜 6探针标记 7杂交 8信号检测RFLP标记（限制性片段长度多态性） 是由限制性内切酶酶切位点间DNA区段发生突变引起的。 特定的DNA/限制性内切酶组合产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有标识，其在DNA分子水平上直接反映了生物的 遗传多态性。 分析流程：DNA提取-酶切DNA电泳转移到滤膜上Southern杂交。 特点

25、：优：无表型效应，即RFLPs检测不受环境条件、生物个体发育阶段以及性别、年龄、表达组织的影响；共显性；非等位的RFLP之间不存在上位互作效应；可利用的探针较多，可以检测到很多遗传位点；RFLP标记可重复性高，结果稳定可靠；RFLP标记普遍存在于各种生物基因组DNA中，标记数量多。 缺： 对生物基因组DNA质量要求高，需求量大；实验操作过程相对复杂繁琐；RFLP受限制性内切酶的类型制约，只有选用一定的限制性内切酶，某个位点才可能表现出多态性；制备检测RFLP标记的探针步骤繁琐，程序较多；具有放射性，对人体有害。基于PCR的DNA标记 根据所用引物的特点，这类DNA标记可分为随机引物PCR标记和

26、特异引物PCR标记。 A随机引物PCR标记，所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区段是事先未知的，具有随机性和任意性。因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。其中RAPD标记使用较为广泛。 RAPD标记（随机扩增多态性） 优：对DNA需求量极少，对DNA质量质量要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。在RAPD标记分析中，通常每次PCR反应枝使用一种引物。 缺：一般表现为显性遗传，不能分显性纯合和杂合基因型；由于使用了较短的引物，PAPD标记的PCR易受实验条件的影响，结果的重复性差。B特异引物PCR标记 其所

27、用的引物是针对已知序列的DNA区段设计的，具有特定核苷酸序列，引物长度通常18-24核苷酸，故可在常规PCR的复性温度下进行扩增，对基因组DNA的特定序列区域进行多态性分析。具有特异性。因此特异引物PCR标记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解。 包括SSR标记（简单重复序列）、STS标记等。 SSR标记（简单重复序列）：又称微卫星DNA，是一类1-6个碱基组成的基序串联重复形成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。 优：微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大方便。微卫星引物的通用性。微卫星DNA呈共显性、检测容易、重复性较好、省时

28、，适合于自动化分析。 设计SSR引物方法：1.相关文献；2.近缘种的引物；3.数据库搜寻法：利用专门的SSR分析软件，搜索GenBank、EMBLheDDBJ等公共数据库中的DNA序列和EST序列获得SSR序列，然后设计引物；4.根据从所研究类群基因组文库中筛选出的一套SSR位点两翼序列设计引物。ISSR标记属于基于PCR的DNA标记 （锚定SSR or简单重复序列间），该技术检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性一般在引物的5或3端接上2-4个嘌呤或嘧啶碱基，以对具有相同重复形式的许多SSR座位进行筛选，使得最终扩增出的ISSR片段不致太多。 其稳定性比RAPD好，呈孟德尔式遗传

29、，具显性或共显性特点。 优点：开发费用低，可以在不同物种间通用，精确度几乎可与RFLP媲美，揭示的多态性较高，检测非常方便。SCAR标记（序列特异扩增区）：是在序列未知的DNA标记（RAPD、AFLP等）基础上，对其特异PCR扩增产物进行回收、克隆和测序，根据扩增产物的碱基序列重新设计特异引物（原标记引物的基础上加10-14个碱基），并对基因组DNA进行PCR扩增。 新的SCAR引物加强了与模板的特异性结合，并提高了退火温度，提高了转化后新的标记检测的专一性。STS标记：是根据单拷贝的DNA片段的两端的序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA产生一段长度为几百bp的特异序列。此序列在基因组中往

30、往只出现一次，因此可标识界定基因组的特定位点。 其获得主要来自于RFLP探针、表达基因序列EST和表达序列标签等。RGA标记：来自不同植物的不同抗病基因都具有一些共同的保守序列，即不同抗病基因具有一定的同源性。 依据基因保守序列设计特异引物来扩增基因组DNA可获得抗病基因类似物（RGA）片段。RGA既可以作为一种基于特异引物PCR的DNA标记，其本身又是潜在的抗病基因。 与现存的随机分布于整个基因组中的DNA标记相比，RGA标记的最大优点是他代表潜在的有用基因。基于PCR与限制性（RE）酶切技术结合的DNA标记。这类DNA标记可分为二种类型:A是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段

31、长度的多态性，如:AFLP标记（扩增片段长度多态性）：其将RAPD的随机性与RFLP的专一性巧妙结合，既有RFLP的可靠性又有RAPD的方便性（是公认的最有效的分子标记）。 缺点：是一种专利技术，受专利保护，费用昂贵；基因组的不完全酶切会影响实验结果，故对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 B是通过对特异引物PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记（扩增片段限制性酶切长度多态性）：实际上是一些特异引物PCR标记（如SCAR和STS等）的一种延伸。 当SCAR或STS的特异性扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，一种补救办法就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼

32、脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。用此方法检测到的DNA多态性就是CAPS标记。 其揭示了特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度的多态性。 基于单核苷酸多态性的DNA标记 (基于DNA序列的标记) 。EST-PCR标记：EST技术的基本实验方法是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体结构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其3或5端进行一步法测序所获得的短的cDNA部分序列，300-500bp，代表一个完整基因的一部分。 EST标记是根据EST序列本身的差异而建立的分子标记。其具有一般分子标记的特点外，还有其特殊优势：信息量大，如

33、果发现一个EST标记与某一性状连锁，那么该EST就可能与控制此性状的基因相关； 通用性好，由于EST来自转录区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高。特别适用于远缘物种间比较基因组研究和数量性状位点信息的比较。 开发简单、快捷、费用低，尤其是以PCR为基础的EST标记。已广泛运用于新基因的发现、种间序列的比较、以及功能基因组学的研究等。 EST-SSR标记：EST通过基因的表达产物mRNA反转录为cDNA，可以定位到染色体的特定位置。许多EST序列包含微卫星。SNP（单核普酸多态性）标记：在DNA序列上某些特定的位置会出现的转换、颠换、插入、缺失等变化的这种序列多态

34、性。它是由DNA序列中因单个碱基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。 优点：SNP数量多分布广，其在基因组中的密度较SSR标记更高，可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。SNP具有二态性特点，在基因组中SNP往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，易于基因分型。SNP具有较高的遗传稳定性；处于基因内部的SNP可能直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此其本身可能就是某些遗传机制的候选位点。遗传图谱构建包括哪些重要环节？通常使用的遗传作图群体有哪些？1、分子遗传图谱的种类：细胞学图谱：反映的是有丝分裂或减数分裂某一时期的染色体经固定和染色

35、后在光学显微镜下可见的一些细胞学结构（着丝粒、端粒、异染色质区、核仁组织区等在染色体上的位置及分布情况。染色体经不同的染料染色后所显示出的各种带型，如C带、G带、R带、Q带，均可以作为细胞学图谱的界标。遗传图谱：指通过遗传重组所得到的遗传标记线性排列图。主要以DNA分子标记为主，一般用厘摩cM来表示遗传标记之间的相对距离，IcM所含的碱基对数目随物种及染色体部位等而异。在同一条染色体的不同区域，重组率存在很大差异，有重组热点区（hot spots）和重组冷点区（cold spots）之分。遗传图谱很难准确反映出标记之间的真实距离。物理图谱：指用遗传重组以外的基因定位方法所得到的基因线性排列图。

36、低精度物理图谱：通过细胞遗传学材料或方法构建的细胞遗传图谱。利用一些细胞学材料借助染色体断点来确定基因DNA标记在染色体上的位置，也可以利用荧光原位杂交（FISH）直接把DNA标记定位到染色体上。细胞遗传图不但可以把遗传、分子以及细胞学信息整合到一起,而且为以染色体为单位来研究基因组组成提供了一个独特的视角。高精度物理图谱：常用方法包括用大的基因组克隆构建重叠群和用稀有酶构建大范围限制性酶切图谱，这一方法对小基因组作物或大基因组作物小范围的精细结构的作图是有用的，但不适合象小麦这样基因组非常庞大、重复序列众多的作物的全基因组的物理作图。2、遗传连锁图谱构建：遗传图谱是指以染色体重组交换率为长度

37、单位的基因组图谱，是对基因组进行系统研究的基础。 在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立自由组合，同源染色体上的连锁基因产生交换与重组，交换的频率随基因间距离的增加而增大，因此可用重组率来揭示基因间的遗传图距，图距单位用厘摩（Centi-MOrgan,cM）表示，1个cM的大小大致符合1的重组率。3、构建遗传图谱的主要环节确定亲本组合，构建作图群体多群体中分子标记的基因型进行分析利用计算机软件构建连锁群4、用于分子标记的遗传图谱（作图群体）可分为两类： 暂时性分离群体 (F2、F3、F4、BC群体、三交群体)，其最主要的特点是易于在短期内构建具充足大小的作图群体。永久性或固定性的作图群

38、体，DH和RIL为永久性的作图群体，它们克服了暂时性群体的不足之处，但构建这样的群体不是难度大，就是耗时长。5、构建遗传图谱常用的软件:目前用于构建DNA标记连锁图的软件有Linkage，Mapmaker, MapManager, Joinmap3.0i等,它们作图的基本原理相同，所适用的群体类型有差别，如Mapmaker3.0目前只能用于DH, RIL,F2,BC群体,不能用于NIL或高代回交群体，操作时应根据群体的类型和作图的要求采用合适的作图软件，并把作图结果用绘图软件直观地表示出来。6、分子遗传图谱与作物改良：1、品种鉴定 ：品种保护 育种的亲本选择；2、种质资源的保存和利用；3、基因（QTL）定位；4、图位克隆基因；5、分子标记辅助选择。基因组测序与组装有哪些策略？他们各有啥优缺点？一个物种基因组测序重要意义？DNA测序方法：链终止法测序：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。技术线路：制备单链模板将单链模板与一小段引物退火加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 化学降解法测序：在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降