病毒滴测定.doc

1、病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。1234GTU （基因转移单位）或转导颗粒（PFU （空斑形成单位）TCID50 （ 50%组织培养感染剂量） 不同的概念缘于不同的滴度测定方法， PFU、TCID50）。1.测定VP的方法是测定病毒颗粒在VP （病毒颗粒）或OPV （光学颗粒单位）BFU即蓝点形成单位，与 GTU类似）这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU260nm处的吸光度（病毒 DNA和蛋白的总吸光度中主 要为DNA, 1个OD值相当于1.1 X 1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中 都较为稳定， 但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。 因此这

2、种方法只能提供病毒的量， 于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。在GFP2. GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞， 一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如 或 LacZ 等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。3. PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。 空斑形成需要许多个感染周期， 得到最终结果通常需要三个星期。 一般来说， 这种方法得到 的结果很少能在其它实验室重复， 即使在同一实验室内， 不同技术员操作也很少能得到相同 的结果。4. TC

3、ID50 已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有 关。许多因素如加入的病毒储存液的量、 管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都 会影响结果。 最近， 出现了两种测定病毒滴度的改良方法。 一种是用更小体积的病毒液进行 感染并在感染过程中不断晃动培养板（ Mittereoler 等， 1996）；另一种方法则在感染时将 培养板进行离心

4、（ 1000 RCF90 分钟）（ Nyberg-Hoffman 等， 1997）。这两个实验室所得到的 结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止， 尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。对于同一管病毒保存液， 不同的方法所得到的结果往往相差 100倍以上， 典型的数据见表 6。 所有结果都只是大概的， 目前最有效的生物学方法 （离心法感染） 能检测到 1 个感染性颗粒 /2 个颗粒。下一部分，我们将详细描述 3 种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要 考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释 和滴定过

5、程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：第一代细胞经冻融后倍数量的细胞经过冻融后用氯化铯方法纯化后10610710810910101011表 6：各滴度测定方法特性方法 类型 时间 可重复性 滴度* 评注 VP 物理学方法 2 小时 好 5 X1012GTU 生物学方法 2 天 可变 2 X1011100PFU 生物学方法 21 天 变化很大 5 X 1010 传统方法TCID50 生物学方法 10 天 可变 2.5 X1011 昆腾公司标准方法以 VP 法测得的 5X 1012 的病毒保存液为标准5.8.1 O.D.260 nm （VP/ml）这

6、种方法只是通过 DNA量来表示病毒滴度。相关系数为1.1 X 1012/ OD260单位。由于大多数分光光度计在 OD直小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒， 因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。1. 4 C融化病毒保存液。2. 在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB （0.1%SDS 10mMTris PH7.4, 1mMEDTH准备二个 病毒稀释度。最小需要量为： 病毒裂解液52ul 52ul168ul 42uls病毒11稀

7、释度：2（稀释液：5（稀释液1013/ml ）用 1：1）2）10和 1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证 OD注意：病毒滴度高时（值在 0.11.0 之间。3. 56 C震荡培养10分钟。0 ufgbjf4. 准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。5. 测定260nm处吸光值：稀释液 1 再稀释 1：5，为稀释液 3。稀释液 2再稀释 1： 5和1： 10，分别为稀释液 4和稀释液 5。测定稀释液5 （2次）、4、3的OD26Q取此4值的平均值作为最终结果。 例如1.2345678910111213将 450ulVLB 和 50ul 稀释液即透

8、析缓冲液加入比色杯中。 记下空白管读数后弃去，不要冲洗。加入 450ulVLB 和 50ul 1 ： 5 稀释样本（稀释液 2），组成稀释液 5。 记下读数后弃去。清洗比色杯，加入样本重复测一次。 清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1 记下空白管读数后弃去，不要清洗。加入 400ul VLB 和 100ul 1 ： 5稀释样本， 记下读数后弃去。清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1 记下空白读数后弃去，不要清洗。：5 稀释空白液。组成稀释液 4。：2 稀释空白液。加入 400ul VLB 和 100ul 1 ： 2 稀释样本，组成稀释液 3。 记下读数后

9、弃去。将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：OD26（X病毒稀释度X测定稀释度X1.1 X 1012= OPU/ml5.8.2 空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染 QBI-293A 细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻 近细胞，直至形成一个成熟的空斑。 这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。 由于许多因素如单层细胞质量、 操作和观察方法等都可影响到最后的结果， 因此这一方法得3 X 105细胞/60mm培养皿O2. 在 12 孔板中稀释病毒， 1ml，其它孔稀释至 3ml, 是未纯化的) ，调节稀释度至10-710-12 。稀释：将100ul病毒保存液加入 900

10、UI DMEM5。用移液器上下吸打 5次，此时稀释度为10-1。 换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%打 5次，稀释度为10-2。然后分别取 300ul 前一稀释液加入 2.7ml DMEM5%， 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。3. 吸去细胞培养液，每个培养皿中加入 混匀，37 C培养90分钟。4. 吸去培养液，按 5.2.2 中所述加入形成一系列稀释度，最后 4 个稀释度用于感染细胞。1ml病毒稀释液和 1ml DMEM5%十字形轻轻晃动1.25%琼脂糖培养基。到的结果往往最不稳定。1. 5 X 105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5培养，3-4小时

11、后等细胞贴壁即可进行病毒感染。 或者在病毒感染前一天加入 储存于-20 C或-80 C备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定(纯化还10-100 个病毒 / 孔，一般为 10-12 ，这样稀释比大约为21 天后应该可以看到5. 37 C培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。 空斑形成的白色小斑点。结果 : 计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成 单位 (PFU/ml) 。5.8.3 50% 组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准

12、方法。5.8.3.1 细胞准备：1.2.3.收集一瓶 QBI-293A 细胞，计数。用 DMEM 2%准备 20ml 105/ml 细胞。用 12道排枪在 2块 96孔板中每孔加入 100ul 细胞悬液。5.8.3.2 准备稀释病毒液1.第1管中加入 0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml 。第 1 管中再加入 0.1ml 病毒保存液。2.上下吸打 5 次混匀。3.换用新枪头。4.从第 1 管中吸取 0.2ml 加入第 2 管中。5.反复稀释至最高稀释度。6.用同一管病毒保存液进行第 2 轮稀释。7.最后 8 个稀释液加入 96 孔板，每孔 0.1ml，每个稀释度 10 孔， 2 孔为

13、阴性对照。阴性对照孔中加入 0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。&37 C培养10天。9. 10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细 胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。10. 计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何 CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。图7: TCID50的典型结果稀释度孔对 照稀释度 比率 3v q- / 210-10 0/10=0 uc% ?0jo#10-9 0/10=0 F78?54dN210-8 2/10=0.2

14、 ' 7<Qo ?g|_?1%0rv> oQ = | d, iE +F ' 5D 8| *gu&o10-7 6/10=0.6 HG1gai 7Z#10-6 10/10=110-5 10/10=1 10-4 10/10=110-3 10/10=1在这一例子中，当稀释度为 10-6 时出现 100%阳性，当稀释为 10-9 时出现 0%阳性。因此，滴度可以用KARBEf统计法精确算出：对于lOOul的稀释液，滴度为 T=1O1+d （ s-0.5 ）d=log10 稀释度=1（对于 10倍的稀释度而言）s=阳性比率之和（从第 1个10倍稀释度开始）=1 + 1 + 1+1+1 + 1+0.6+0.2+0+0=6.8。虽然一些低稀释度在测定中省略了（如 10-1和10-2 ），但在计算时仍应以阳性比率为1来算。滴度： T=101+1 （6.8-0