细胞毒性实验方案

1、细胞毒性实验设计方案1.准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPB多4%甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包0.45卩m滤膜灭菌：50mL 10mL 5mL离心管两种枪头2. 实验方案本实验所用的 材料 为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。 本实验的 目的 为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为 SiO2-SS-HA/DOX SQ-SS-HA、DOX

2、SiO2-SS-HA/DOX、空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型：培养基的配置：双抗 1%血清 12%DMEM87%具体操作步骤：细胞的复活： 将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入 37 r温水中，使细胞快速溶解。 将悬浮的细胞移至离心

3、管中，加 5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心 去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离 心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。 ) 将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代：将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C,每次使用 一管，避免反复冻融。 将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷 75%勺酒精放入超净台。 将培养液倒入废液缸， 残留培养基用吸管吸干净， 操作完成后， 培养瓶口 用火烧。 加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈 圆形，即消化完毕，加入2mL12%DMEM止消化，用枪吹打，

4、使细胞悬浮。 将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDME培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入 2mLDMEM至5mL于37C, 5%勺CO培养箱中培养48h。 下一次传代步骤同 -。细胞存活率测定方法(布板，加样) 同传代步骤 -。 给每个离心管中加入定量的培养基， 并用移液枪来回吸， 使液体混合均匀，将所有含有细胞的培养基转移到一个 50mL离心管中，最终使液体体积为30mL 96 孔板中每个浓度设计 5 个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空 白调零孔，每孔加入

5、100卩L含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保 持一定的湿度，5%(v/v)CO2,温度保持在37C,培养22小时。 将0.03g谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基， 作为对照， 不需要加谷胱甘肽的孔换上新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37r，培养2小时，具体的加样孔见图一。 将1.2mg的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培养基中，分成两份，其中一份里加入1.5mL的培养基，

6、再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入1.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiOaSS-HA/DOX样品。 SiO2-SS-HA 样品勺浓度配制方法同上。 将0.918mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到3mL的培养基中，剩下的步骤同 。 将配制好的载体溶液替换原来 96孔板中的培养基，如图 1 所示。将孔板 放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2,温度保持在37r，培养24小时。 配制5mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成 MTT溶液，将孔板放入 培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37r。培养4小时 后，将孔

7、板中的培养基取出，用 PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为 490nm(2).以L929成纤维细胞为正常细胞模型体布板示意图实验组为 SiO2-SS-HA/DOX SiOSS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。实验目的为测定药物载体溶液对正常细胞的细胞毒性。培养基的配置：双抗1%t清12%DMEM87%具体操作步骤:细胞的复活: 将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入 37 r温水中，使细胞快速溶解。将悬浮的细胞移至离心管中，加 5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心 去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，

8、将之前的离 心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) 将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代:将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C,每次使用一管，避免反复冻融。 将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷 75%勺酒精放入超净台。 将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口 用火烧。加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈 圆形，即消化完毕，加入2mL12%DMEM止消化，用枪吹打，使细胞悬浮。 将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。 迅速倒掉上清，加入 6mLDMEI培养基，分装至两个

9、培养瓶中，再各加入2mLDMEM至 5mL于37C, 5%勺CO培养箱中培养48h。 下一次传代步骤同-。细胞存活率测定方法(布板，加样)同传代步骤-。给每个离心管中加入定量的培养基，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀, 将所有含有细胞的培养基转移到一个 50mL离心管中，最终使液体体积为12mL 96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养 液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空 白调零孔，每孔加入100卩L含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保 持一定的湿度，5%(v/v)CO2,温度保持在37r，培养22小时。 将所有加样的孔换成新

10、鲜培养基， 作为与癌细胞的对照。将孔板放入培 养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37r，培养2小时。将0.4mg的SiO2-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培养基中，分成两份，其中 一份里加入0.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入0.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO2-SS-HA/DOXW品。SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。 将0.306mg的SQ-SS-HA/DOX羊品溶到1mL的培养基中，剩下的步骤同 。 将配制好的载体溶液替换原来 96孔板中的培养基，如图2所示。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37C，培养24小时。配制5mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成 MTT溶液，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5%(v/v)CO2，温度保持在37C。培养4小时 后，将孔板中的培养基取出，用 PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100卩L的DMSO溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为 490nm细胞存活率米用百分比表示：细胞存活率=(OD