病毒的分离与鉴定.doc

1、病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本 7杀灭杂菌（青、链霉素）7接种易感的动物出现病状鸡胚7病变或死亡细胞培养7细胞病变7鉴定病毒种型（血清学方法）无菌标本（脑脊液、血液、 血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成1020%悬液离（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是:易感的动物7出现病状检验标本7杀灭杂菌（青、链霉素）7接种 鸡胚7病变或死亡7鉴定病毒种型（血清学方法）细胞培养7细胞病变无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清 ）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培 养液洗液洗涤后制成1020%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、

2、感染组织或 昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。1 细胞培养 用分散的活细胞培养称细胞培养 （Cell culture ）。所用培养液是含血清 （通 常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，PH7.27.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。原代细胞培养（Primary cell culture）用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37 C孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细 胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因

3、原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。二倍体细胞培养（Diploid cell cultune）原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如 WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196 C ）内，做为 种子”供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用 于病毒的实验室诊断工作。传代细胞培养（Co ntinous cell culture）通常是由癌细胞或二倍体细胞突

4、变而来（如Hela、He p-2、 Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在 液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。表5.病毒增殖用部分细胞系及来源细胞系名称来源二倍体细胞系HDCS ,MRC-9 ,WI-38传代细胞系人胚肺细胞，人宫颈癌细胞，人上皮细胞，猴肾细胞，地鼠肾细胞Hela ,He p-2 ,Vero ,BHK（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本 T杀灭杂菌（青、链霉素）T接种易感的动物出现病状鸡胚T病变或死亡细胞培养T细胞病变T鉴定病毒种型（血清学方法）无菌标本（脑脊液、血液、血浆、

5、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10 20%悬液离淋巴细胞培养（Lymphocyte culture ）正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子（IL-2 ）后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒（ HIV、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。2 .动物试验 这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根 据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或

6、静脉，例如嗜神经病毒（脑炎病 毒）接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠（一周龄）腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有 死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。3 .鸡胚培养 用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡 胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、 尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养；但很多病毒在鸡胚中不生长。（二）分离病毒的鉴定1 .病毒在细胞内增殖的指征（1）细胞致病作用（Cytopathogenic effect,CPE）病毒在细胞内

7、增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE,普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。免疫荧光（ IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的 病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的 特异性判断为何种病毒感染。表6.病毒在细胞内增殖的指征病毒增殖指征CPE病毒小RNA病毒单纯疱疹病毒腺病毒副粘病毒细胞园缩、单层破坏 细胞肿大变园 细胞变园堆积成葡 HIV非CPE病毒正粘病毒副粘病毒风疹病毒鼻病萄状多核巨细胞（合胞体）红细胞吸附现象干扰并阻 毒止其他病毒（如EC

8、HO病毒）的细胞致病作用（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本 T杀灭杂菌（青、链霉素）T接种易感的动物T出现病状鸡胚T病变或死亡细胞培养T细胞病变T鉴定病毒种型（血清学方法）无菌标本（脑脊液、血液、 血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成1020%悬液离（2）红细胞吸附现象（Hemadsorption phenomenon ） 流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时,以细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应 的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现

9、象不仅可 作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。（3 ）干扰现象（Interference phenomenon）一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO 病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。2.病毒感染性的定量测定空斑形成单位（Plaque-forming unit ,PFU）测定 这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化 的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内

10、复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层 细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中 显出没有着色的 空斑”清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用 每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。（2） 50%致死量（LD50 ）或50%组织细胞感染量（TCID50 ）的测定 本法可估计所含病毒的感染量。 方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起 50% 发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬 液作 10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如 绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50% 感染量或50% 组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。3病毒形态与结构的观察 病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察 到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因 组织构、序列同源性比较加