东师实验1血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定

1、综合研究性实验一：血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定一.实验目的1.掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；2.掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法；3.掌握凝胶过滤层析的技术方法；4.掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。二.血清清蛋白与-球蛋白的盐析、透析与浓缩 一实验试剂和仪器1.试剂（1）血清（2）PBS（3）(NH4)2SO4溶液（4）双缩脲试剂（5）酪蛋白（6）蔗糖（7）蒸馏水（8）BaCl溶液2.用品与仪器（1）离心机（2）烧杯（3）移液管（4）透析袋二血清清蛋白与-球蛋白的盐析（一）蛋白质盐析的实验原理1.蛋白质分子是生物大分子，其大小恰好在胶体的范围

2、，且分子中亲水基团多位于分子的表面，疏水基团多在分子结构内部。因此，蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在，形成胶体溶液。2.蛋白质在水中形成亲水胶体，亲水胶体颗粒有两个稳定因素：（1）胶粒上的电荷；（2）水化膜。3.蛋白质在水溶液中呈现两性电离。在环境的pHpI时，蛋白质可带正电荷或负电荷。在某一pH条件，蛋白质带同种电荷，同电相斥，故可吸引水分子（水分子为极性分子），水分子排列围绕在蛋白质分子周围，形成水化膜，使蛋白质分子相互分割开来。破坏这两个因素或其中某一个因素（破坏了蛋白质胶体的稳定性），易于蛋白质发生沉淀。4.高浓度盐溶液，在水溶液中电离，其正、负离子吸引水分子，从而夺取水化膜，还可以中

3、和部分电荷。这样，就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素，使蛋白质凝聚、沉淀，这就是蛋白质的盐析。5.由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同，对于同一种中性盐，蛋白质盐析所需最低浓度也不同。例如：球蛋白不溶于半饱和的(NH4)2SO4溶液，-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液，而清蛋白仅不溶于饱和的(NH4)2SO4溶液。因而。可以利用不同浓度的(NH4)2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。（二）血清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤血清清蛋白与-球蛋白的盐析实验步骤取离心管一支，加入2mL血清加入2mLPBS（稀释血清），摇匀逐滴加入pH=7.2

4、的(NH4)2SO4溶液2mL，边加边摇静止30min，离心20min（v=3000rpm）上清液（主要含有清蛋白）沉  淀（主要含有-球蛋白）加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和加1mLPBS溶解静止30min逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液0.5mL(相当于33%饱和 (NH4)2SO4溶液)离心、沉淀加1mLPBS溶解沉淀放置30min放入透析袋离心20min（v=3000rpm）*放弃离心后的上清液（主要是、球蛋白），沉淀即为初步纯化的-球蛋白三血清清蛋白的透析与浓缩（一）蛋白质透析与浓缩的实验原理1.透析（1）透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的

5、一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。（2）由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。2.浓缩利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。（二）蛋白质透析与浓缩的实验步骤1.取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。2.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，将烧杯放在微量振荡器

6、上振荡1h（中间换水1-2次）。3.将透析袋取下，小心将线绳解开，用滴管吸收袋内的液体放入干净的试管中。4.用双缩脲法分别检查袋内外液体蛋白质。在用BaCl溶液检查烧液体的NH4+和SO42-。记录实验现象，观察透析法除盐的结果。溶液名称所加试剂名称实验现象分光光度计读数蒸馏水双缩脲试剂4mL  酪蛋白双缩脲试剂4mL  袋内溶液双缩脲试剂4mL  袋外溶液双缩脲试剂4mL  袋外溶液BaCl溶液 除盐结果 5.将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。三.凝胶层析一凝胶层析的实验原理1.凝胶层析也称凝胶

7、过滤，是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术。2.当样品流经这类凝胶的固定相时，不同分子大小的各组分因进入网孔受阻滞的程度不同而以不同的速度通过层析柱，从而达到分离的目的。3.当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或较难通过网孔而进入凝胶颗粒，而是沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快，即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分子量较小的物质，因为颗粒直径小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。本实验用的是重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液通过Sephandex G-200凝胶柱。二实验试剂和用品1.试剂（1）Se

8、phandex 4B 凝胶（2）生理盐水（3）重铬酸钾（4）蓝葡聚糖2.主要实验用品（1）铁架台（2）凝胶柱（3）玻璃棒（4）烧杯（5）试管（6）胶头吸管三凝胶层析的实验步骤凝胶层析的实验步骤过程名称实验步骤凝胶预处理4g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中50mL蒸馏水小火煮沸1h静止、冷却、倾弃蒸馏水加入PBS10mL轻轻搅拌至凝胶悬起倾入10cm×1.0cm层析柱（用玻璃棉堵住下口，下口套一橡皮管）装柱    将全部凝胶都倾入柱内，且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，在将柱内凝胶面上平铺一张小圆滤纸片，然后小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液

9、体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。加样    用胶头吸管将滤纸上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口，安装生理盐水加入装置。洗脱    用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到6-7dpm。收集混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。四实验结果实验结果1.洗脱曲线例子实际洗脱曲线2.实验结论 四.血清清蛋白与-球蛋白的鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）一醋酸纤维素薄膜电泳的原理1.醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋

10、酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。2.醋酸纤维素薄膜是用二乙酸纤维素制成的，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅为120m，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为取代电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用广泛、没有吸附等特点。二醋酸纤维素薄膜电泳的实验步骤醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤浸泡    将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。点样    用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。电泳    将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。染色    将薄膜取出后，置于氨基黑