农杆菌感受态制备

1、EHA105于含50 ag/ m链霉素平板划线,28 C培养。？m 振荡培pm 离 心 5 m i体转化农杆菌取1 ag左右的质粒DNAra入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min, -70 C放置10min。再在37C水浴5min或42C水浴1min,接着冰浴2min,加入800mlYM液体培养基28C, 175rpm摇培3hr后涂在含50 g/mlKan a my c in的 YM平板上。2 8 C培养到形成单菌落。其中YM可以用LB代替，第一次的CaCI2溶液可用溶液（）DTT）版本二？普通农杆菌感受态制备与转化:1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif2

2、0mg/ml ）中28C过夜活化。2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28C生长至OD6O0勺等于左右(4hr)。 ?3. 5k rpm 离心5分钟。？4. 在10ml NaCI中悬浮细胞。？5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCI2。?如不是马上使用，可以将之按 200ul分装储存于-80 C待用。6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置 30分钟。？7. 液氮中冷冻1分钟。？8. 37 C水浴溶化细胞。？9. 力口 1ml YEP培养基，28C摇床培养2-4hr （低速）。10.离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。11

3、.涂板，28C培养2-3天。？版本三？ 农杆菌感受态细胞的制备？1. 挑取少许农杆菌LBA4404接种于5ml LB液体培养基（含50mg/L STR）中, 28C、200r/mim 培养过夜。？2. 取2ml培养物于LB液体培养基（含50mg/L STR）中继续培养，直至OD800为左右。？3. 将培养物置冰浴中30min, 4C、5000r/min、离心5min,弃去上清液。？4. 用10ml冷的L NaCl悬浮菌液。？C、5000r/min，离心5min,弃去上清液。？ 6.用1ml冷的CaCI2 (20mmol/L)悬浮，分装成50卩l /管，液氮中冷冻后至-80 C保存。？农杆菌感受

4、态细胞的制备:1.试剂配制：solution1Rbcl lOOmM?50mM?K-Acetate 30mM?10mM?Glycerol 15% 15ml，定容至 100ml。?pH= 121度，高压灭菌30min。?solutio n2 : Rbcl 10mM?K-Acetate 10mM?75mM?Glycerol 15% 15ml，定容至 100ml。?pH= 121度，高压灭菌30min。?2. 农杆菌感受态细胞的培养: 15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度 120转震荡培养过夜。(注意牙签和小三角瓶均需灭菌)3. 制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小

5、三角瓶中的农杆菌分装到小离心管中，室温下，4，OOOg，离心10min。弃去上清，每管加solution1 ，用手指 弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置 15mim-2h。4度，4，OOOg, ?离心10mi n。取出后放在冰上，弃去上清，每管加solutio n2 ，用手指弹管 底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim分装 感受态农杆菌，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-8O C冰箱中保存。版本四？1）从新鲜YEP（5g/LNaCI, 1Og/L胰蛋白胨，1Og/L酵母浸出物，1Og/L琼脂，50mg/L利福平，）平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落，接种于5ml液 体YEP培养基（含50m

6、g/L利福平）中，28C 200r/min振摇培养过夜。？ 2）取1ml菌液接种于50ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，28 C 200r/min 振摇培养至 OD60（为。?3）冰浴30min, 4C 5000r/min 离心收集菌体，重悬浮于 10ml L NaCl溶液中。？4）再次4C 5000r/min 离心收集菌体，重悬浮于 1ml 20mmol/LCaCl2溶液中，按200µ/管分装。制备好的感受态细胞若不立即使用， 液氮速冻1min后，放于-70 C冰箱保存，半年内使用。版本五？YEB培养基（用于农杆菌培养及感受态制备）蛋白冻（pepto

7、ne ） 5g/L?蔗糖（sucrose ） 5g/L?牛肉膏（Beef extract ） 1g/L?酵母提取物(Yeast extract ) 5g/L?硫酸镁(MgSO4?7H2O L?固体培养基加琼脂粉，高压灭菌。农杆菌电击感受态制备？方法一 ？1、挑取单菌落于YEB振荡过夜28C培养。？2、以1:200接种于400500mlYEB培养基中（2000ml三角瓶中），摇菌至,冰浴 10min。?3、2000g , 4 C离心10mi后弃上清，用预冷的10%甘油重悬沉淀。？4、3000g,4C离心10min弃上清，用回流甘油重悬沉淀后集中在一管中。5、3000g , 4C离心10min弃上

8、清，用回流甘油重悬沉淀。6、50卩1分装一管，70C保存。？方法二？1、O/N culture in 10ml of Y EB/Rif 100+Str 100 at 282、1:100 dilution宀grow till OD600=，on ice 30 min;?3、Pellet at 6000rpmfor 20min in precooled centrifuge, then resuspend with 1 Vol of precooled H2O;?4、Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with Vol of precooledH2O;?5、P ellet at 6000rpm for 20mi n, then resus pend with 1/50 Vol of precooled 10% glycerol;?6、P ellet at 6000rpm for 20mi n, then resus pend with 1/500 Vol of precooled 10% glycerol;?7、Aliquot 80 卩 l. ?农杆菌化学感受态制备？1、挑取单菌落于YEB振荡过夜28 C培养；？ 2、1:50接种于50mlYEB培养基中2