3130简明使用手册

1、 AppliedBiosystems 3130简明使用手册AppliedBiosystems 3130/3130XL 简明使用手册DATA COLLECTION V3.0美国应用生物系统公司中国公司否否否是是是是仪器准备P7需要空间定位？运行测序样品？进行空间定位P11进行光谱校正P12需要光谱校正？运行片断分析样品？上机运行P29编制测序样品板文件P20编制片断分析样品板文件P27结果分析，参考相关手册一DNA 测序或片段分析的流程：1.样品制备： 样品制备即是在DNA片断上用化学的方法标记荧光素。 标记上荧光素后就可以对DNA片断进行检测和确认了，一般每一 DNA分子标记一个荧光素分子，最

2、多有五种荧光素可用于DNA样品的标记。 不同的样品制备方法选用不同的荧光素和试剂的组合，样品制备可在96孔或384孔板进行2.软件设置：操作人员根据所使用的标记方法、电泳的毛细管长度、电泳胶的种类等，在数据采集(Data Collection)软件中选择正确的运行模块和分析模块。 3.开始运行：操作人员把样品板放到仪器上并开始运行，仪器便会根据设定好的顺序，用相应的电泳程序分析样品板上的样品。 4.电泳：用“电进样”的方法将带电的样品分子加到灌好电泳胶的毛细管的进样端（负极）， 然后在毛细管两端加上直流电压，样品中不同大小的DNA片段开始从负极向正极移动， 移动的速度受到片段自身大小影响，片断

3、越短移动得越快。电泳的结果是使长度不同的 带电 DNA 片断互相分离，并且按片段的长短的顺序通过检测窗口，产生信号，短片段先到达检测窗口。5.激发和检测：当标记有荧光素的DNA片断移动到检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号，此荧光信号被CCD检测器所检测并被转化为电信号传递到计算机。6.数据采集和处理：CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了Data Collection软件的计算机工站。工作站接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把这些数据存贮在计算机的数据库里。 7.自动数据提取和分析：接着，工作站会自动地从数据库中提取这些数据，并根据不同的运行

4、模式，完成对样品DNA的碱基序列或片断信息的分析，然后把分析完成后的结果数据以样品文件的形式保存于计算机的硬盘中。8.结果：分析好的样品文件可以用序列分析软件或片断分析软件来打开查看结果，如有必要，这些数据可以改用不同的分析参数进行重新分析。 电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度，图上不同颜色的信号线代表了样品制备时所使用的不同的荧光素（对于测序结果，每种颜色代表一种碱基），图中的每个峰代表一个DNA片断。 测序样品的结果图片断分析的结果图二仪器硬件结构：1.仪器前视图： 泵胶块胶管胶瓶阳极缓冲液杯胶泵（PDP）连接管 . 下胶块 2.各部件功能：l 电源开关：打开或关闭仪器电源；

5、l 照明灯开关：打开或关闭仪器内部的照明灯； l 阳极缓冲液杯：内装1X缓冲液，电泳时作为阳极介质； l Buffer杯：装1X缓冲液，电泳时作为阴极介质； l 水杯：装去离子水，清洗毛细管用或放废胶；l 泵胶块：泵入胶并将其灌入毛细管； l 下胶块：上装有阳极，阳极缓冲液杯装在此处；l 恒温加热炉：保证电泳时，毛细管处于一个均一、稳定的温度环境中；3.仪器后视图：注意：请保持激光冷却风扇的出口通畅！三实验操作：1.仪器准备：开机：开机的顺序一定是先开电脑再开仪器。l 开启UPS电源，确保UPS处于电池供电状态，稳定5分钟；l 打开显示器和电脑的电源开关，登录到WIN XP桌面；l 检查确保仪

6、器的加热炉门和仪器左右前门；l 打开仪器电源开关，仪器进行一系列的初始化后，绿色状态灯亮，仪器启动完成。仪器的状态指示灯的不同状态显示了仪器处于不同的工作状态，具体请参考下表：状态指示灯操作l 仪器已就绪l 关门状态下进行向导操作绿灯长亮l 继续实验l 程序运行中绿灯闪烁l 仪器与电脑无法联机黄灯长亮l 确认已进入WIN XP界面l 确认网线连接正确l 确认前门关闭l 仪器下载firmwarel 仪器自检l 加热炉门打开l 前门打开l 开门状态下进行向导操作黄灯闪烁l 确认前门，加热炉门已关闭l 故障红灯长亮l 关机后等待30秒后开机l 若上一步无效则打开DC3.0软件，进入以下界面 GA I

7、nstruments > ga3130 >instrument name > Instrument Status >Event Log. 查看日志中最后一条信息，根据相应错误代码来解决问题l 若依然无法解决问题，联系ABI工程师打开Data Collection3.0软件：l 选择Start> Programs >Applied Biosystems >Data Collection >Run Data Collection v3.0. 或双击桌面快捷方式。l 等待Service Console窗口中的指示灯全部变成绿色后，DC软件的界面打开，过

8、程如下：冲洗Water Seal：1、 在20ml的注射器里装上20ml去离子水（水温40ºC以下），将注射器装到右图中2号的位置；2、 将1号和2号位上的螺母都放松1/2圈；3、 用烧杯在1号口底下接收流出来的水，然后慢慢地压注射器，使水通过Water Seal后从1号口流出，要求使用水的体积在10ml以上；4、 拧紧2号位上的螺母，再拧紧2号位上的螺母；5、 取下20ml注射器，冲洗步骤完成。安装毛细管：l 在DC软件中，选择GA Instruments>ga3130>instrument name>.l 在工具栏中，选择Wizards>Install A

9、rray Wizard.l 按照向导提示操作l 安装好毛细管以后运行毛细管空间定位程序spatial calibration注意：l 不要拉扯毛细管l 使用原包装来储存使用过的毛细管，其末端分别放在缓冲液槽和小玻璃瓶中l 安装毛细管时要戴无粉手套更换新的胶：l 在DC软件中，选择GA Instruments > ga3130 >instrument name >.l 在工具栏中，选择Wizards,然后选择Replenish Polymer Wizard进行同种类型的胶的更换，选择Change Polymer Type Wizard进行不同类型的胶的更换。l 按照向导提示操作

10、注意：l 每天都要检查胶块和连接管中有无气泡；l 确保有足够量的胶每轮消耗约50-80ul；l 每星期都要更换胶；l 使用过期的胶可能会影响数据质量；l 请戴无粉手套操作。准备缓冲液：l 把5ml 10X缓冲液与45ml MilliQ水混合成1X缓冲液；l 按下Tray按钮，待自动进样器停止移动后开门；l 取下缓冲液槽，水槽和废液槽，拆开并用水清洗；l 晾干，在各槽中加入相应的溶液；l 擦干各槽后将其放回仪器相应的位置上；l 取下阳极缓冲液杯，倒空后先用水淋洗再用1X缓冲液洗；l 加入缓冲液；l 将阳极缓冲液杯装回原处。注意：l 溶液槽组装好后，请仔细检查，橡胶垫是否平整；l 1X缓冲液在28

11、度可放置1个月，室温可放置1星期；l 请每24小时更换仪器上在使用的缓冲液；l 如果有胶冲入阳极缓冲液杯中请更换缓冲液。2.毛细管空间定位 ( Spatial Calibration ):什么是毛细管空间定位？毛细管空间定位程序把每道毛细管的荧光信号落在CCD上的位置标记出来，从而使DC软件能够找到这些信号。何时作毛细管空间定位？1 安装新毛细管或用过的毛细管后；2 移除或调节了毛细管检测窗口的位置；3 移动仪器后。如何作毛细管空间定位？l 选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Spatial Run Scheduler.l

12、 若毛细管中充满了新胶，选择Protocol> SpatialNoFill_1，否则选择Protocol> SpatialFill_1l 点击Start按钮l 评估定位结果，各道的信号高度应该相差不大，间隔13至16之间，确认所有毛细管都有信号，如图：l 若接受定位结果，按Accept按钮，否则按Reject按钮若空间定位失败l 重复以上过程进行定位l 若无效，观察系统中有无气泡，去除气泡后再进行空间定位l 若无效，重新安装毛细管的检测窗口，进行空间定位l 若无效，取下毛细管，用枪吸取无水甲醇冲洗毛细管检测窗口上的凹槽，如图l 待甲醇晾干后将毛细管装回，进行空间定位检测窗口的前表面

13、l 若无效，更换毛细管3.光谱校正（spectral calibration）：什么是光谱校正？从下图可以看到，四（或五）色荧光检测系统的本质是检测四（或五）种荧光素在其中心发射波长处的信号。由于每一种荧光素的发射光谱不是锐线光谱，而是 一种有一定宽度分布的光谱带。所以一个纯荧光除在它自己光谱的中心波长处能采 集到信号N1外，在其他荧光信号光谱的中心波长处亦能检测到信号而产生信号重叠。为了校准信号重叠，需知道一种荧光信号在其他荧光信号处产生的重叠系数。 所以，我们用四（或五）条不同长度的片断分别标记上不同的荧光素来计算这些系数。最后得到一个（或）的数据矩阵。 何时作光谱校正？l 使用新的荧光染

14、料l 激光或CCD被调节或更换后l 不同颜色的荧光间出现干扰（有拔起或下压峰）l 参数的改变（荧光类型，毛细管类型和毛细管长度）如何作光谱校正？两种类型的校正标准样品样品准备l 按照试剂盒说明书用Hi-Di甲酰胺混合校正标准样品l 震荡离心l 95度变性5分钟后立即冰浴2分钟l 震荡离心l 在样品板中加入样品（96孔板加10ul，384孔板加5ul）l 用橡胶垫装配样品板，装配后橡胶垫必须平整，样品板上的孔与橡胶垫上的孔要对齐，如图橡胶垫未对齐样品孔橡胶垫未对齐样品孔橡胶垫未对齐样品孔橡胶垫对齐了样品孔l 短甩离心，<1500g X 5sl 确认所有孔的样品都在底部,如右图l 按下图组装

15、样品板 样品在底部样品板固定器橡胶垫样品板样品板基座组装好的样品板注意！固定器与橡胶垫的孔一定要对齐， 否则会损毁毛细管！固定器与橡胶垫的孔没有对齐创建光谱校正用的protocoll 选择GA Instruments > ga3130 >Protocol Manager.l 在Instruments Protocols界面中点击New按钮l 在Name中为Protocol命名l 在Type下拉菜单中选择Spectrall 依次选择正确的DyeSet、Polymer、Array Length、 Chemistry和Run Module，点击OK。创建光谱校正板l 选择GA Instr

16、uments > ga3130 >instrument name > Plate Manager.l 点击New按钮，在弹出窗口中分别输入以下信息样品板名字可选项：样品板的相关描述选择Spectral Calibration选择96-well输入所有者的名字输入操作者的名字点击OK按钮l 在Spectral Calibration Plate Editor dialog界面中，输入以下信息样品名 相关信息 前面创建的Protocoll 点击OK按钮，则一个样品板记录创建完成运行光谱校正板：l 选择GA Instruments > ga3130 >instrumen

17、t name > Run Scheduler.l 将样品板放到自动进样器上，注意板的方向，此时RunScheduler界面中板的指示块由灰色变为黄色l 点击FindAll按钮，找到光谱校正的样品板的文件名l 点击该文件名后，再点击黄色的板的指示块，此时，指示块将右黄色变为绿色l 在DC软件的工具栏中，点击，在随后的对话框中点击OK来开始运行确认光谱校正成功/失败状态l 选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Instrument Status > Event Log.l 查看各道毛细管的状态,如下图l 相关标准 毛

18、细管位置 是否成功 Q值 Condition number查看光谱校正结果l 选择GA Instruments > ga3130 > instrument name > Spectral Viewer.l 在Dye Set下拉菜单中，选择相应的荧光染料l 在样品板图上选择某个孔来查看其光谱校正结果Dye Set ZDye Set EDS-33(G5)故障排除症状可能原因解决方法无信号样品预处理问题更换样品，使用新的HI-DI甲酰氨样品板中有气泡离心光谱校正失败或显示“No candidate spectral files found”毛细管阻塞手工命令灌胶，观察毛细管在阴极的

19、喷胶情况来判断其是否阻塞毛细管未充满胶检查是否有毛细管断裂，重新灌胶过期的光谱校正样品检查保质期和储存条件，必要的话更换新批号的样品有很多杂峰胶过期更换新胶气泡，尤其在胶中l 使用Bubble Remove向导灌胶l 使用前要使胶升温至室温l 更换过期的胶胶污染更换新胶4.设置DNA测序程序创建Instrument Protocoll 选择GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.l 在Instrument Protocol界面中，点击New按钮l 填写弹出的Protocol Editor窗口名字描述选择REGULAR按照下表的内容选择相应

20、的Module按照下表的内容选择相应的Dye SetRun ModuleDye Setl 点击OK按钮创建Analysis Protocoll 选择GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.l 在Analasis Protocol界面中，点击New按钮l 选择Sequencing Analysis，点击OK按钮l 填写General菜单名字和描述按下表选择相应的序列文件格式文件格式选项含义Write .Seq File .seq文件用文本文件格式来打印序列或用在其它软件中l ABI格式用于Applied Biosystems软件l FAST

21、A格式用于其它软件Write Standard Chromatogram Format file (.scf)创建.scf文件用于其它软件Write Phred (.phd.1) File当KB basecaller同时被使用时，创建.phd.q文件来用于其它软件l 填写Basecalling菜单选择合适的basecaller和DyeSet Primer如果愿意，可以选择分析的中止点选择Quality Threshold选项选择True或Flat ProfileProcessed Data选项功能使用同一的标准来处理显示数据，使得其最强区域的峰高为一固定值。处理后的图谱与原始图谱类似。不同的区

22、域不同处理，使得中间区域（>约40碱基）的峰高相平注意：只能在使用KB basecaller分析时使用，若使用ABI basecaller必须用True ProfileQuality Threshold选项功能使用KB basecaller时，每个位置都要分配一个碱基和相应的QV值使用KB basecaller时，低于设定的QV值的位置标记Ns，依然会显示其QV值l 填写Mixed Baeses菜单（只有在使用KB Basecaller选项时才能激活该菜单）选择Use Mixed Base Identification选项设置相应的检测域值（默认为25%，不能低于15%）l 在Clear

23、 Range菜单中，选择相应方法l 点击OK按钮保存设置 Result Group，具体如下，设置完成后，点击 OKl 选择GA Instruments > Results Group.l 点击New按钮创建新Result Group或Edit按钮编辑已有的Result Groupl 填写General界面填写名字 填写所有者（可选）填写描述（可选）l 填写Analysis界面分析类型中选择Sequencing Analysis选择是否需要程序结束后自动分析l 填写Destination界面（若想使用默认文件夹位置则跳过以下内容）点击Use Custom Location选择框自定义文件

24、夹位置点击Browse按钮来浏览文件夹位置点击Test按钮来测试选择的文件夹位置是否成功l 在Naming界面中按自己的习惯定义命名规则创建序列分析样品板记录l 选择GA Instruments > ga3130 >Plate Manager.l 点击New按钮l 在弹出的New Plate Dialog窗口中填写以下内容样品板名字样品板描述（可选）选择相应的测序程序选择96孔板输入所有者和操作者的名字点击OK按钮l 在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中，填入相关内容n 在Sample Name栏中填入样品名n 在Comments栏中填入相

25、关描述n 在Results Group 1栏中选择上面创建的Result Groupn 在Instrument Protocol 1栏中选择上面创建的Instrument Protocoln 在Analysis Protocol 1栏中选择上面创建的Analysis Protocoll 使用Fill Down功能来完成有相同设置的样品填写l 若想让样品运行一轮以上，选择Edit > Add Sample Run并填写相关信息l 点击OK按钮5.设置片段分析程序创建Instrument Protocoll 选择GA Instruments> ga3130 > Protocol

26、Manager.l 在Instrument Protocol界面中，点击New按钮 l 填写弹出的Protocol Editor窗口名字描述选择REGULAR选择GeneMapper36_POP7选择G5点击OK按钮Run Modules:DyeSet:设置Results Group，参考第24页，只需将分析类型改为GeneMapper。创建片段分析样品板记录l 选择GA Instruments > ga3730 >Plate Manager.点击New按钮l 在弹出的New Plate Dialog窗口中填写以下内容样品板名字样品板描述（可选）选择相应的GeneMapper程序选

27、择96孔板输入所有者和操作者的名字点击OK按钮l 在弹出的GeneMapper Plate Editor界面中，填写以下信息1. 在Sample Name栏中，输入样品名2. 在Comment栏中，输入相关描述3. 在Sample Type栏中，选择样品类型4. 在Size Standard栏中，选择合适的内标5. 在Panel栏中，选择合适的panel6. 在Analysis Method栏中，选择合适的分析方法7. 在Snp Set栏中，选择合适的SNP8. 输入相关的用户自定义信息9. 在Result Group 1栏中，选择合适的Result Group10. 在Instrument Protocol 1栏中，选择上面创建的pr