ELISA方法诊断隐孢子虫抗原

1、单抗介导的夹心ELISA方法的建立摘要：将纯化的隐孢子虫卵囊制备免疫原，经油相苗、水相苗共6次免疫，制备了兔抗安氏隐孢子虫抗体。提纯后用HRP标记IgG抗体，标记后的HRP浓度为1.4 mg/mL，IgG浓度为1.755 mg/mL，酶/抗体摩尔比为1.18。选用3B10单抗与酶标兔抗建立了夹心ELISA试验，单抗的最佳稀释度为1：200，酶标抗体的工作浓度为1：400800。在3种待检样品的处理方法中，以样品经超声波破碎后置液氮-37反复冻融后再检测，效果最好；乙醚脱脂处理后再同上处理，结果OD值稍低；未经冻融处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品OD值显著偏低。夹心ELISA最低检出限为含

2、100个卵囊/mL粪样。特异性试验表明：该方法对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力，其OD值与牛C. andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。 引 言目前，隐孢子虫的诊断方法主要有直接镜检、染色镜检、免疫学方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等。目前研究较多的是免疫学方法和分子生物学方法。1990年Robert报道了检测牛粪便中卵囊抗原的ELISA方法，取得了较好的效果。目前，国外已有商品ELISA检测试剂盒。国内张西臣1996年报道了双抗体夹心ELISA检测病原的初步研究，尹继刚应用双夹心-ELISA对60份牛粪便样本检

3、查,并与抗酸染色法比较发现, ELISA敏感性比抗酸染色强，且不与牛球虫、结肠小袋虫发生类属反应。作者在前两个试验的基础上，初步进行了夹心ELISA试验，为今后制备诊断试剂盒，用于水源、环境中隐孢子虫的检测做前期的准备。1.材料与方法1.1材料抗牛源安氏隐孢子虫的单克隆抗体制备见实验二，使用的为其中的3B10单抗，上清效价为6400，腹水效价为102400。多抗为兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体，琼扩效价为1：8。酶标单抗和酶标多抗均为自己标记。酶标羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物公司。健康无隐孢子虫的雄兔和雌兔各一只，购自中牟县某养兔场，各种隐孢子虫、球虫、猪等孢球虫均为本实验室分离保存。试剂及器材:

4、(1)0.1M NaIO：称取241mg高碘酸钠(上海浦东化学试剂厂 20010523)溶于蒸馏水10mL中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc(天津科密欧化学试剂开发中心 20031107) (1.361克50mL) 3.7mL0.2M HAc (0.601mL50mL) 6.3mL加蒸馏水至2,000mL。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸馏水至50mL再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH（FLUKA进口分装 20040726）溶液(4mgmL):临用时称取NaBH4mg

5、溶于1mL蒸馏水中。(5)0.01M PH7.4 PBS。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂(8)纯化的兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体。(9)HRP(上海雪满生物科技有限公司20041228， RZ>3.0，酶活力：300u以上/mg)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。1.2方法隐孢子虫抗原，采自西郊某奶牛场阳性牛，经蔗糖浓度梯度离心纯化后，用PBS调整卵囊浓度为2×108个/mL左右。将上述提纯卵囊置超声波细胞粉碎仪上以80%的功率粉碎6分钟，然后将粉碎物置液氮和和37冻融5-6次，经3500rmi

6、n-1离心10分钟，测定上清中性液蛋白含量，可溶性抗原用于抗体检测，使用部分可溶性抗原和全部沉淀（非可溶性抗原）制备免疫原。将上述抗原的一部分（冻融的上清和破碎的卵囊碎片）混合物加2倍量的弗氏完全佐剂乳化制成油苗。另一部分不加油佐剂，作为水苗。免疫，首先用油苗免疫，每只兔子免疫1mL,背部皮下多点注射和腹腔注射相结合。免疫兔用全价饲料饲养于清洁动物房内。免疫兔从颈静脉放血，血液置于灭菌平皿中，于37自然析出血清。兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体的提纯 参照实验二的方法提纯和测定兔抗体的浓度。 IgG抗体的标记参照董邦全54的方法略加改进，标记步骤如下：(1)称取5mgHRP溶解于1mL双蒸水中。(

7、2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化的HRP的PH升高到9.09.5，然后立即加入含适量IgG的1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1mL新配的4mgmL NaBH液，混匀，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.01M PH7.4 PBS透析，4过夜。(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。(8)3000rmin-1离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二

8、次，最后沉淀物溶于少量0.01M PH7.4的PBS中。(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.01M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，4500rmin-1离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。结果判定：IgG量(mgmL)(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62工作浓度的选择55 先将抗原用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10gmL左右，酶标板内，每孔100l，4过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。用1%的BSA封闭（37孵育1小时）洗涤3次。酶标记抗体用0.01M的PBS液依次稀释成1100，1200，140

9、0，1800，11600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度4-8孔，每孔100ul，37孵育1小时后洗涤。然后加底物溶液，每孔100ul，室温1015分钟。以2M HSO 50ul终止反应。检测样品的制备标准阳性粪样，采自粪检阳性牛场；标准阴性粪样，为粪便集虫后，显微镜下检验看不到卵囊，即为阴性的牛粪；交叉反应粪便，仅有鸡球虫的鸡粪样、猪等孢球虫的猪粪样、有牛小球隐孢子虫感染的牛粪、有鸵鸟隐孢子虫的鸵鸟粪样等。将这些粪样用0.01M的PBS稀释后过滤，参照粗提卵囊的方法处理这些样品。标准阳性卵囊样品在计数后，稀释成不同的浓度，进行冻融、破碎、或乙醚除脂等处理后用于实验。用0

10、.05M PH9.6包被缓冲液适当稀释兔抗/单抗 (),于微量酶标板每孔加100,置4过夜后,用PBS-T洗涤液洗3次。用1%的BSA封闭（37孵育1小时），洗涤3次甩干。每孔加待测样品100l,同时设阴性和试剂空白对照,放置37反应1,用0.0MPBS-T洗液洗涤3次。每孔加适当稀释的酶标抗体1001置37反应1,用洗涤液洗涤5次。每孔加底物溶液100,室温暗处放置1015显色,每孔加终止反应液50。然后在酶标测定仪上测定450处的值。以样品孔的值()与阴性对照孔的值()之比大于2(即/>2.1)时定为阳性。通过点阵分析法确定用于检测一定浓度抗原所需抗体()和酶标抗体的工作浓度。将兔抗

11、体/单抗()浓度分别稀释成不同浓度，虫卵浓度分别为107、106、105、104、103和102个/，酶标抗体也配成不同的稀释度。在工作浓度选择中,以/>2.1时,兔抗体/单抗()浓度最低、酶标抗体稀释度最高为最适条件。对1份猪等孢球虫卵囊而无隐孢子虫卵囊的猪粪样，有小球隐孢子虫卵囊而无球虫的牛粪，有鸡球虫粪样、有鸵鸟隐孢子虫的鸵鸟粪样按前述方法处理后进行ELISA检测。 对若干含隐孢子虫的牛粪样分别进行抗酸染色和ELISA检测，对检测结果进行比较。对相同样品分次进行检测，比较检测结果的一致与否。 2.结果与分析2.1兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体的制备与标记抗原制备两种，第一种制成油苗后含可

12、溶性抗原1.2mg/mL,颗粒性抗原6.5×107个/mL。第二种抗原未加免疫油佐剂，颗粒性抗原1×108个/mL，可溶性抗原1.24mg/mL。实验兔经表5所示的6次免疫后，合计共免全卵囊（超声破碎混合物）数为3.5×108个/只。第6次免疫后15天时测定血清抗体琼扩效价为1：8，此时采血制备血清，按实验二中辛酸硫酸铵法提纯IgG，测定其蛋白含量为18.49mg/mL。表5.实验兔的免疫途径及免疫剂量Tab5. The vaccine dosage, usage of immunized rabbit免疫次数immune-time免疫途径usage剂量（mL/只

13、）dosage间隔时间（天）interval抗原量(个/mL) antigen quantities1皮下多点注射1（油乳苗）146.5×1072皮下多点注射1（油乳苗）146.5×1073皮下多点注射1（油乳苗）146.5×1074腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）105×1075腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）75×1076腹部皮下/腹腔注射0.5（水乳苗）5×107将上述提纯的抗体分两次标记HRP，测定第二次的酶结合物中HRP浓度为1.4 mg/mL，IgG浓度为1.755 mg/mL，酶/抗体摩尔比为1.18。均在合适的浓度

14、范围内。2. 2酶标记抗体的工作浓度的选择 将新制备的抗原（新）稀释10g/mL、5g/mL分别包被酶标板,以前制备的抗原（原）按1:100包被板子,4过夜后用PBS-T洗涤三次,每次2分钟,加入不同稀释度的酶标兔抗隐孢子虫抗体,置37作用1小时,加入底物溶液后置室温显色1015分钟,终止反应,酶标仪读数。结果见表6,表7。表6.酶标1号抗体的工作浓度选择.Tab6.The selection of antibodyseemLy dilution抗原的浓度 不同稀释倍数的酶标抗体OD值Antigen dilution HRP-antibody OD value of the different

15、 dilution multiple 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL0.644 0.604 0.575 0.495 0.337 0.260 0.188 0.131 0.095 0.074 0.050 0.621 0.576 0.536 0.444 0.331 0.257 0.183 0.122 0.092 0.072 0.050新10g/mL0.75 0.562 0.477 0.376 0.305 0.199 0.132 0.108 0.087 0.074 0

16、.057 0.75 0.526 0.464 0 .334 0.265 0.184 0.124 0.097 0.075 0.061 0.051原1:100 1.033 0.970 0.823 0.840 0.734 0.594 0.433 0.376 0.181 0.159 0.101 1.110 1.063 0.838 0.599 0.628 0.625 0.346 0.424 0.172 0.162 0.134 1.066 0.888 0.852 0.669 0.655 0.487 0.052 0.046 0.047 0.046 0.035 表7.酶标2号抗体的工作浓度选择Tab7.The

17、selection of antibodyseemLy dilution抗原的浓度 不同稀释倍数的酶标抗体OD值Antigen dilution HRP-antibody OD value of the different dilution multiple 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL. 0.831 0.711 0.702 0.635 0.607 0.579 0.565 0.437 0.311 0.218 0.057 0.3740.052 0.741 0.

18、672 0.749 0.639 0.607 0.533 0.460 0.315 0.219 0.064 0.548新10g/mL 0.724 0.664 0.679 0.639 0.579 0.535 0.437 0.334 0.248 0.149 0.056 0.606 0.057 0.692 0.667 0.619 0.594 0.515 0.444 0.341 0.228 0.148 0.057 0.461原1:100 1.244 0.840 0.889 0.919 0.744 0.630 0.618 0.561 0.502 0.433 0.309 0.903（+） 1.290 1.08

19、1 1.102 0.953 0.878 0.776 0.686 0.619 0.555 0.465 0.344 1.345（+） 1.140 1.164 1.177 0.998 0.877 0.767 0.710 0.643 0.552 0.468 0.338 1.434（+）由上述两表可见：酶标1号抗体的工作浓度为：1：200400，2号抗体的工作浓度为1：400800为合适的工作浓度。将两标记物各加50%甘油，分别混匀后分装，放-20保存备用。2.3不同处理方法对样品检测结果的影响将待检样品分别做以下处理：1.粗提后不加处理，2.经超声波破碎后反复冻融处理，3.经乙醚除脂后再破碎冻融。分别

20、将以上方法处理的样品根据卵囊计数结果分别配成不同稀释度的检样进行检测，结果见表8。在合适的条件下（抗体包被浓度10g/mL，二抗工作浓度为1：800时），样品经超声波破碎后加液氮-37反复冻融后再检测，效果最好；乙醚处理后再同上处理，结果OD值稍低；未经处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品OD值显著偏低。表8.不同处理方法对检样的测定结果的影响Tab8. The influence of the different processing to result包被 酶标 不同方法处理的样品浓度 抗体 the sample of the different processingcoating HR

21、P-AB 未处理隐孢子虫样品 破碎反复冻溶的样品 乙醚+破碎反复冻溶的样品 dilution unhandled sample sonicate +freeze-thaw ethyl ether+ sonicate +freeze-thaw g/mL 106 105 104 103 5×106 5×105 5×104 5×103 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.262 0.153 0.116 0.116 0.727 0.556 0.262 0.195 0.629 0.492 0.

22、185 0.1291：400 0.158 0.107 0.096 0.095 0.651 0.177 0.199 0.117 0.527 0.395 0.145 0.1071 1：800 0.202 0.102 0.092 0.099 0.524 0.270 0.140 0.105 0.295 0.198 0.111 0.128 1：400 0.114 0.078 0.087 0.096 0.535 0.216 0.113 0.131 0.218 0.144 0.119 0.150表9.不同单抗包被的夹心ELISA检测结果Tab9. The results of different McAbs

23、 coating in Sandwich ELISA单抗名称 不同抗原含量样品的OD值McAb name The OD value of the different antigen 1：100 1：400 1：1600 1：6400 1：25600 1：1024001A3 0.369 0.276 0.274 0.278 0.270 0.268 3B10 0.566 0.561 0.495 0.472 0.485 0.5283F4 0.265 0.233 0.191 0.181 0.178 0.1704B3 0.585 0.369 0.304 0.268 0.248 0.2682.4不同单抗的E

24、LISA 效果试验 将腹水1：50稀释后包被酶标板，放4过夜。用1.5%的明胶封闭371小时。加处理过的抗原1.0×108个/mL，可溶性抗原浓度：1.24mg/ mL。按1：100，1：400，1： 1600，1：6400，1：2560，1：102400加入。按测定的酶标抗体的工作浓度加入酶标抗体。加入二抗，显色-终止读数（结果见表9）。结果在同等条件下五株单抗以4B3的吸附效果好，且不同卵囊量的样品OD值有一定的梯度,又因其酶标效价也较高，就选用该单抗与酶标兔抗作夹心ELISA试验。 将单抗作不同的稀释度，与不同浓度的抗原反应，结果见表10。当单抗1：200、抗原1：5000稀释

25、时的OD值为0.211，与阴性比较值大于2.1，为阳性，将1：200定为单抗的最佳稀释度。表10.不同稀释度单抗与酶标多抗的夹心ELISA结果 Tab10.The result of different dilution of McAb and HRP- Multiple-antibody in ELISA单抗稀释度 不同稀释度抗原的OD值 McAb dilution The OD value of the different antigen 1：100 1：500 1：2000 1：5000 - 1：200 0.500 0.312 0.240 0.211 0.0911：600 0.447 0

26、.281 0.220 0.194 0.0781：1800 0.367 0.267 0.209 0.197 0.069将单抗与多抗稀释成不同的浓度包被酶标板，以不同处理的隐孢子虫抗原适当稀释后加入酶标板中吸附，再用酶标记的兔抗牛安氏隐孢子虫抗体反应后读数。比较结果见表11、表12。在以10ug/mL浓度包被时，多抗对隐孢子虫卵囊抗原的识别能力较强，处理过的抗原在5000个/mL时OD仍达到0.7以上，但整个稀释系列的结果差别不大，即呈现明显的非特异反应；而单抗在这个包被浓度对处理抗原的识别力低，但敏感性增强，OD值与抗原稀释度之间呈明显的负相关。比较二者在较低的包被浓度时，得到类似的结果。表11

27、.兔抗牛安氏隐孢子虫抗体铺底的夹心ELISA结果Tab11.The results of Multiple-antibodies of rabbits coating in ELISA包被 酶标 不同方法处理的样品浓度 抗体 the sample of the different processingcoating HRP-AB 未处理隐孢子虫样品 破碎反复冻溶的样品 乙醚+破碎反复冻溶的样品 dilution unhandled sample sonicate +freeze+ thaw ethyl ether+ sonicate +freeze +thawg/mL 106 105 104

28、103 5×106 5×105 5×104 5×103 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.736 0.696 0.400 0.319 0.667 0.687 0.688 0.640 0.723 0.782 0.765 0.753 1：400 0.686 0.624 0.297 0.277 0.749 0.690 0.716 0.659 0.765 0.735 0.652 0.7071 1：800 0.593 0.444 0.219 0.325 0.748 0.677 0.682 0

29、.626 0.733 0.646 0.584 0.568 1：400 0.533 0.415 0.198 0.266 0.676 0.590 0.605 0.542 0.662 0.616 0.546 0.551 表12.单抗(4B3)+兔抗牛安氏隐孢子虫抗体夹心ELISA结果Tab12.The results of McAb (4B3) coating in ELISA包被 酶标 不同方法处理的样品浓度 抗体 the sample of the different processingcoating HRP-antibody 未处理隐孢子虫样品 破碎反复冻溶的样品 乙醚+破碎反复冻溶的样品

30、dilution unhandled sample crushing +freeze+ thaw ethyl ether+ crushing +freeze +thawg/mL 106 105 104 103 5×106 5×105 5×104 5×10 3 5×106 5×105 5×104 5×10310 1：800 0.262 0.153 0.116 0.116 0.727 0.556 0.262 0.195 0.629 0.492 0.185 0.1291：400 0.158 0.107 0.096 0.0

31、95 0.651 0.177 0.199 0.117 0.527 0.395 0.145 0.1071 1：800 0.202 0.102 0.092 0.099 0.524 0.270 0.140 0.105 0.295 0.198 0.111 0.128 1：400 0.114 0.078 0.087 0.096 0.535 0.216 0.113 0.131 0.218 0.144 0.119 0.150表13.夹心ELISA的特异性试验Tab13.The specific test of Sandwich ELISA样品 牛安氏C.P 鸡球虫 猪等孢球虫 猪小球隐孢子虫 鸵鸟隐孢子虫

32、阴性对照samples bovine chicken Isospora pig Ostrich negative C. andersoni coccidium suis C. parvum Cryptosporidium contrl浓度（个/mL） 10000 10000 10000 10000 10000 无 OD值 0.538 0.197 0.236 0.621 0.498 0.097 2.4夹心ELISA的特异性试验将含有鸡球虫、猪等孢球虫、猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫的粪样粗提后，配成各含卵囊10000个/mL的浓度再做反复冻融处理，与同法制备的同浓度牛安氏隐孢子虫的样品同板检测，各

33、样品的OD值如下表13。结果可见，对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力，其OD值与牛C. andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。2.5敏感性试验通过对7份隐孢子虫含量不同的牛粪样分别进行ELISA检测和抗酸染色的结果表明：夹心ELISA最低能检出含100个卵囊/mL粪样为阳性，而同一份样品所制的五个抗酸染色玻片有四个都检不到卵囊。2.5重复性试验对同一样品分次实验的结果表明，OD值在每次测定之间差别不大，说明该方法重复性好。3.结论与讨论3.1抗体制备与标记一般要求标记的抗体活性高,效价高(最低116),纯度高，亲和力好，然后

34、还要具备高质量HRP，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。因为隐孢子虫卵囊个体较大，抗原成分复杂，直接用于免疫其抗原性还不如病毒和细菌。免疫印迹试验表明，自然感染动物血清识别较好有效的有效抗原为冻融出的水溶性抗原，但单纯使用水溶性抗原免疫效果不好。我们本次使用的兔抗体经三次油乳剂苗和三次水相苗免疫，而且全部为全卵囊破碎冻融后的混合物制备的，历时两个多月，琼扩效价才达到1：8。经提纯后，IgG的纯度和浓度提高了，标记后的抗体效价达到检测的要求。标记抗体时，标记时所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制，室温搅拌时须要求避光，室内温度一般在20以上为宜。否

35、则会影响标记效果。我先期标记单抗时，就因为上述几项指标没有严格把握而导致标记效率低，酶标抗体效价偏低而影响使用。3.2样品冻融处理提高检测效果以往报道的ELISA检测方法，样品要经福尔马林-醋酸乙酯、蔗糖液或饱和盐水等漂浮处理，也有报道53使用含EDTA的PBS液过滤后直接检测，且不影响检测效果。本试验采用蔗糖漂浮法初步提纯，以除去粪便中大量的杂质，而后根据卵囊中的水溶性抗原更易被抗体识别的特点进行冻融处理，尔后进行检测，减少了非特异性的反应，提高了检出率。是否有更为简便、有效、可靠的处理方法还有待于进一步的试验摸索。在检测粪样时，一定要破碎、冻融数次后才能用于测试。3.3单抗的种属特异性本试

36、验所用的单抗可以检出多种隐孢子虫，表明不同种的隐孢子虫具有共同抗原。本试验的建立的方法不仅可以检查牛安氏隐孢子虫，也可以检测驼鸟隐孢子虫、鸡贝氏隐孢子虫、猪小球隐孢子虫，张西臣等用小球隐孢子虫的单抗建立双抗夹心-ELISA方法，检测兔粪便中、牛粪便中隐孢子虫卵囊抗原，该方法不仅能检出小球隐孢子虫还能检出鼠隐孢子虫。表明试验中所采用的单抗是针对两种虫体的卵囊壁的抗原决定基。在这点上与我们的试验结果相似。3.4隐孢子虫的诊断方法目前常用的隐孢子虫诊断方法主要有直接镜检法、抗酸染色法、免疫学方法、及PCR方法等。直接镜检法存在费时费力，检出率低的弊病，而且需要观测者有一定的实践经验；抗酸染色法掌握不好会出现着染过浅、过深和非特异性染色等情况出现；免疫学方法特异性强，灵敏度高、稳定性好，易于掌握，特别是单抗的应用使得这些免疫学方法的优点更为突出。常用的免疫学方法主要有：免疫印迹（Westren-blotting）、免疫酶染色（IEST）、间接血凝（HI）、流式细胞免疫检测（FC