牛初乳中乳铁蛋白的分离和纯化_徐丽萍

1、年第期食品工业科技牛初乳中乳铁蛋白的分离和纯化徐丽萍（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨）摘要：利用超滤、盐析和层析三种方法，采用单因素实验和正交实验对酸牛乳清中的乳铁蛋白进行分离和纯化，得到盐析的最佳条件为：先以硫酸铵除去杂蛋白，然后在°，硫酸铵进行盐析。用进行层析，进样量为，洗脱液为时可以得到乳铁蛋白纯品。凝胶电泳结果表明，牛初乳中乳铁蛋白的纯度为，分子量大约为±。关键词：乳铁蛋白，牛初乳，分离，纯化，分子量：，：（），°，（），±：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：作者简介：徐丽萍，女，硕士，副教授，研究方向：食品科学。乳铁蛋

2、白（，）是一种铁结合糖蛋白，广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它能够参与铁的转运，对肠中的铁离子具有增溶作用，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能，。由于乳铁蛋白具有广泛而独特的生物学功能和理化特性，作为食品、医药等领域的新兴成员，正在受到越来越多的关注。随着乳铁蛋白作用、功能、机制的不断阐明和开发应用范围的不断扩大，它在治疗、营养补充、食品等方面将有着广阔的应用前景，因此，非常具有开发和研究价值。本文的目的旨在研究从酸牛乳清中分离、纯化乳铁蛋白的最佳条件，并对其进行定性和定量分析。材料与方法材料与设备牛初乳国家乳品工程技

3、术中心提供；标准乳铁蛋白电泳级，；火棉胶，磷酸二氢钠磷酸氢二钠缓冲液。电泳仪（）北京市君意机电技术公司制造；数控计滴自动部分收集器（）上海沪西分析仪器厂；小型离心机（）北京医用离心机厂；光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司；板式超滤器北京医用设备厂。实验方法乳铁蛋白粗品的制备通过超滤法制备乳铁蛋白的粗品，实验条件如下，实验膜：膜（醋酸纤维素）；超滤装置：板式超滤器；工作压力：；料液温度：°。取牛初乳，先用截流分子量为的超滤膜进行首次超滤，然后用截流分子量为的超滤膜对滤过液进行第二次超滤，最后用截流分子量为的超滤膜进行浓缩，即得乳铁蛋白粗品。乳铁蛋白的分离杂蛋白的分离分别取试管，准确

4、称量份含乳铁蛋白粗品，加入适量磷酸盐缓冲液（），依据计算结果，缓慢滴加饱和（），使上述各管中硫酸铵浓度分别达到，和。于室温下静置过夜，下离心分离，将沉淀物用的磷酸盐缓冲液溶解，定容至，分别测定其在处的值。乳铁蛋白分离条件的确定根据单因素实验得出的最适硫酸铵、温度和，对盐析工艺参数采用（）表进行正交实验，将沉淀收集，溶解，定容，测定其在处的值，方法同前。因素水平表见表。验证实验根据正交实验确定的盐析的最佳工艺技术年第期，食品工业科技工艺条件，对乳铁蛋白进行盐析，并测定其在处的值，方法同前。根据乳铁蛋白的标准曲线计算乳铁蛋白含量，根据结果对实验进行调整。透析将盐析得到的沉淀溶于蒸馏水，注入火棉胶制

5、成的透析袋，将透析袋置于蒸馏水中，在恒温水浴箱内透析，中间将透析环境中的蒸馏水更换次，用检测透析液，无白色沉淀则表明透析完成。乳铁蛋白的纯化取透析液上层析柱（×），进样量为。洗脱剂为，缓冲液（磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲溶液）分别为，和，其中含有的，洗脱流速为。收集第一个吸收峰的样品，并将其用缓冲溶液定容至，测其在处的值。乳铁蛋白的分子量分析采用非连续性凝胶电泳，电泳条件为：凝胶浓度，。样品的制备：样品用的溶液溶解，加入（）的巯基乙醇，煮沸，冷却至室温，加入（）的甘油和（）的溴。结果与分析分离杂蛋白通过超滤得到的乳清浓缩液中，除了乳铁蛋白之外，还含有杂蛋白，因此需要用盐析法将其分离出去，

6、并要确保所分离的杂蛋白中不含乳铁蛋白。在这个过程中，盐的浓度是考虑的唯一因素。不同硫酸铵浓度所获沉淀中的值见表。从表可以看出，在硫酸铵的饱和度由变化到时，的值为，即可以肯定所分离的杂蛋白中不含，因此确定的硫酸铵为沉淀杂蛋白的最佳盐浓度。乳铁蛋白分离条件的确定依据正交实验的统计计算，得盐析法沉淀乳铁蛋白的最佳工艺条件为饱和硫酸铵的浓度为，温度为°，为。直观分析图见图。由图可看出，在硫酸铵浓度高于时，它对沉淀量的增加并没有贡献，因此出于经济因素的考虑，将进行沉淀的硫酸铵最佳浓度定为，最佳温度为°，最佳为。由直观分析图还可看出，这三个因素对沉淀量的影响依次是温度盐浓度。对最佳分离

7、条件的验证根据前面的实验结果，用的硫酸铵沉淀杂蛋白，在硫酸浓度为，温度为，为的条件下分离，结果测得的值为，根据的标准曲线得出此时的提取浓度为，由此证明在最佳工艺条件下提取出的是最高的。乳铁蛋白的纯化经过透析之后得到乳铁蛋白样品，还要通过柱层析进行进一步的提纯，以得到浓度和纯度都很高的样品。实验选择进行层析分离，能够选择性地吸附在层析柱上，用含有的进行线性梯度洗脱，在浓度为左右时，被洗脱下来。此法不仅操作简便，而且能够保持产品活性。在对洗脱液的检测上，当为时具有明显的吸收峰。乳铁蛋白分子量的确定通过电泳图谱（图）获知非连续凝胶电泳中的的纯度大约为，和低分子量的标水平因素硫酸铵浓度（）温度（

8、76;）硫酸铵浓度（）在沉淀中的值（×）表乳铁蛋白盐析正交实验因素水平表表硫酸铵的浓度与沉淀中乳铁蛋白的值（）图盐析法分离乳铁蛋白的直观分析图硫酸铵浓度温度图乳铁蛋白的电泳图谱（凝胶浓度，）工艺技术年第期食品工业科技准蛋白相比较，估计的分子量大约为±。结论该实验通过采用超滤分离、盐析分离和柱层析三种方法，实现了酸乳清中乳铁蛋白的分离与纯化，并对得到的乳铁蛋白进行了定性和定量分析。该方法操作简便，容易掌握，而且能够保持制品的活性，具有一定的实用价值。参考文献：郭本恒，孔保华保健与功能食品黑龙江省科技出版社，姜冬梅，李艳华，赵泽民乳铁蛋白铁吸收效果的研究中国乳品工业，（）：，（

9、）：陈季旺，姚惠源，张小勇，陈正行米糠可溶性蛋白的提取工艺和特性研究中国油脂，（）：沙棘子对超临界萃取蜂胶有效成分的影响刘晶晶，张盛木，章晋武，徐培娟（常熟理工学院生物与食品工程系，江苏常熟；南昌大学食品科学教育部重点实验室，江西南昌）摘要：通过单因素实验研究，发现在超临界萃取蜂胶过程中添加一定量的沙棘子能显著提高超临界蜂胶成分的得率。蜂胶沙棘子时，超临界蜂胶得率达到，黄酮类化合物占超临界蜂胶的，随着沙棘子含量的进一步增加，蜂胶萃取得率不再显著提高。关键词：超临界萃取，蜂胶，黄酮类化合物：，：；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：作者简介：刘晶晶（），女，讲师，硕士，研究方向：食品科学。蜂胶（）是蜜蜂采集植物芽孢和树干上的树脂，并混入其上颚腺分泌物及蜂蜡等的一种天然活性物质，临床上具有抗菌、消炎、抑制病毒、镇痛、促进组织再生、抗癌、增强机体免疫功能等作用，可以作为食品天然防腐剂、食品保鲜剂、护肤剂、抗氧化剂等，广泛应用于药品、食品和化妆品等领域。当前国内外普遍采用萃取蜂胶的工艺主要是乙醇提取法。但是蜂胶原胶在溶于乙醇时生成了一种多酚咖啡酸聚合物，呈黑色，味差，难入口；而且易产生新的过敏源，且重金属不易从蜂胶提取物中分离出来。超临界流体萃取技术，特别适合用于萃取油溶性活性成分。然而，蜂胶中富含的黄酮类化合物等有效成分在超临界流体中的溶解度极低。通过本实验的研究，运用超