灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织TGFβ1和COⅣ表达的阻碍

1、灵芝多糖对糖尿病大鼠肾组织TGF-B1和CO-IV表达的阻碍毛春谱，李小毅，张红梅，林桂芬，李伟【摘要】目的观看转化生长因子Bl(TGF-81)及IV型胶原(C0-IV)在糖尿病大鼠肾组织中的表达及灵芝多糖干与后的阻碍。方式腹腔注射链胭佐菌素(STZ)诱导大鼠造成糖尿病模型，分组予不同剂量灵芝多糖(GLP)进行医治性灌胃。8周后，用免疫组化方式和RT-PCR方式检测各组大鼠肾皮质TGF-8、-八/的蛋白和由皿人表达。结果糖尿病组大鼠肾小球TGF-3一、CO-IV蛋白和mRXA表达较正常对照组明显升高(PO；灵芝多糖各组较糖尿病组表达降低(POo结论灵芝多糖可能通过下调糖尿病大鼠肾脏中TGF-P

2、1和CO-N的表达，减少细胞外基质积聚，起到对糖尿病大鼠肾脏爱惜作用。【关键词】灵芝多糖；糖尿病肾病；转化生长因子81；N型胶原Abstract：ObjectiveToinvestigatetheexpressionsoftransforminggrowthfactor-Betal(TGF-P1)andtypeIcollagen(CO-IV)inthekidneyofdiabeticratsandtheeffectsofGanodermalucidumpolysaccharides(GLP)onsuchratmodelwasinducedbystreptozocin(60mg/kg)andth

3、eratsweredividedinto5groupsrandomlyandtreatedwithdifferentdoseweekslater,theexpressionofTGF-P1andCO-IVinkidneytissuewasdeterminedbyimmunohistochemistryandRT-PCRwithgroupC，theexpressionsofproteinandmRNATGF-B一、CO-Isignificantlyincreasedinglomeruli(P<).Theabnormalexpressionsoftheseproteins>mRNAwe

4、redramaticallyimprovedindiabeticratsbyGLPtreatment(P<).ConclusionGLPhassomerenalprotectiveeffectondiabeticrats,throughinhibitionofexcessivedepositionofglomeruliextracellularmatrixbyinhibitingtheexpressionofTGF-P1anddecreasingthesynthesisofCO-IV.Keywords：Ganodermalucidumpolysaccharides；Diabeticnep

5、hropathy；Transforminggrowthfactor-P1；TypeIVcollagen随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年升高。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最重要的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病要紧的死亡缘故之一。目前,单纯西药尚不能有效阻止糖尿病肾损害的自然进程，灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，为滋补强壮，扶正固木的珍品，它的有效成份超级丰硕，要紧有灵芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides,GLP)、三葩类化合物、灵芝酸、腺甘等，其中GLP是最有效的活性成份之一。灵芝的药理活性大多和

6、GLP有关，其具有普遍的药理活性1,能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，排除自由基，抗氧化2,抗辐射和降低血脂3等作用，但对DN的作用报导很少。本研究采纳免疫组化和RT-PCR方式观看灵芝多糖不同剂量组对糖尿病大鼠肾组织的转化生长因子Bl（transforminggrowthfactor-P1,TGF-Bl）和IV型胶原（typeNcollagen,CON）的表达转变，旨在探讨GLP对DN的爱惜机制41材料与仪器清洁级雄性SD大鼠50只，体质量180220g（徐州医学院实验动物中心）。STZ（美国Sigma公司），灵芝多糖（河北保定施达科生物工程技术，批号：RM051215）。一抗别离为兔抗

7、大鼠TGF-13一、CO-IV抗体、SP-6001试剂盒及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术）,TotalRNA提取试剂、RT-PCR试剂盒（大连宝生物）。LEICAQwin图像处置与分析系统（德国），罗氏血糖仪（上海罗氏公司），日立7600型全自动生化分析仪检测（日今日立公司）。2方式糖尿病模型的成立和实验分组将50只SD大鼠随机分为：正常对照组（C组，n=10）,糖尿病组未医治组（DM组，n=10）,灵芝多糖低剂量组（GLP-1组，n=10）,灵芝多糖中剂量组（GLP-2组,n=10）,灵芝多糖高剂量组（GLP-3组，n=10）,分笼饲养。DM组和GLP一、GLP-二、GLP-3组大鼠在禁

8、食12h后，于左下腹腔一次性注射STZ（溶于mmol/L柠檬酸缓冲液,pH）60mg/kg,72h后,尾静脉采血测随机血糖2mmol/L,持续3d以上作为模型纳入本实验。C组仅予以等量柠檬酸缓冲液腹腔注射。40只大鼠经检测均造模成功。模型成立3d后GLP-一、GLP-二、GLP-3组别离给予灵芝多糖水溶液100,200,400mg/kg剂量进行医治性灌胃，C组和DM组用等体积生理盐水灌胃。所有大鼠实验期间自由饮水进食，不利用胰岛素及其他降糖药物。每隔1周测量体质量（BodyWeight,BW）以调整用药量。标本搜集持续观看8周后搜集标本。代谢笼中搜集24h尿,离心保留于一20的冰箱待测尿微量白

9、蛋白（UAER）o称量体质量后,用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血测血糖（BG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、尿素氮（BUN）、血肌酎（Ser）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）0用4冰凉生理盐水灌洗后摘除双肾，去包膜滤纸吸干血迹后称重左肾，左肾重（KW）和体质量的比值作为肾脏指数（KI）的指标。取肾皮质置于10%中性福尔马林中固定，以备光镜、免疫组织化学研究；余肾皮质置DEPC水处置过的EP管，液氮冻透后保留于-70C的冰箱待测RT-PCRo生化指标的测定BG采纳葡萄糖氧化酶法检测，UAER采纳胶体金双抗体夹心法检测，HbAlc采纳亲和层析法检测，BUN、Scr、TC、TG由日立7600型

10、全自动生化分析仪检测。常规光镜检测肾组织经10%福尔马林固定，常规脱水、包埋，切片厚4um,行HE染色和免疫组化。免疫组化研究采纳SP二步法，石蜡切片厚4Um后常规脱蜡至水，3%H202阻断内源性过氧化物酶后，微波加热暴露抗原，滴加一抗TGF-B1（1：100）、CO-IV（1：120）,4冰箱留宿，PBS洗片后滴加二抗，37孵育lh,DAB显色操纵在35min,复染、脱水、透明、封片。以吸光度值（A）表示，显色强度用LEICAQwin图像处置与分析系统进行分析，以每张切片随机取10个视野的肾小球进行半定量分析。RT-PCR研究由基因库别离查得大鼠TGF-B、C0-IV及3-actin的mRN

11、A核甘酸序列，PCR引物用PrimerPremier引物设计软件设计，由上海生工生物工程技术效劳合成（见表1）。表1大鼠转化生长因子-Bl（TGF-P1）、CO-IV及B-actin引物序列（略）取肾皮质100mg,加液氮研碎后，用Trizol（大连宝生物工程）提取总RNA。提取的总RNA测0D值：0D260/0D280值在之间。别离取1Ug总RXA以AMV1（大连宝生物工程）为逆转录酶作逆转录反映，cDNA产物保留于-20。优化PCR扩增条件，使PCR扩增在对数期内进行。别离进行TGF-Bl、CO-IV与B-actin扩增。在DA扩增仪(EppendorfMastercylergradien

12、t)上进行PCR扩增。TGF-P1的反映参数为942min,9445s、6245s、7245s共35个循环；CO-IV的反映参数942min,9445s、6445s、7245s共35个循环；B-actin反映参数为942min»9445s、5745s、7245s共35个循环。取PCR扩增产物5u1在%琼脂糖中电泳，ImagemasterVDS成像系统摄影存盘后应用运算机图像分析软件(TotallabV1.01)行灰度扫描分析。以目的基因与-actin的PCR产物条带灰度Volume之比作为反映目的基因mRXA水平的相对指标。统计学处置计量资料用土s表示，应用SPSS统计软件进行统计分

13、析，组间比较采纳单因素方差分析。3结果一样情形和常规生化指标DM组大鼠在实验期间多饮、多尿、多食、体质量减轻、毛色无光泽、生长发育迟缓等病症十分明显。8周时DM组与C组相较，BG,KI,HbAlc,UAER显著升高，而KW明显下降(P&lt;),Scr,BUN,TC,TG各组不同无统计学意义，GLP各组医治后BW增加，KI降低，UAER指标明显改善，尤以灵芝多糖高剂量组明显(P&lt;),但BG、HbAlc不同无统计学意义。结果见表2。表2灵芝多糖对糖尿病大鼠血生化指标、肾脏指数及尿微量白蛋白的阻碍（略）一样形态学改变DM组大鼠较C组系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜

14、增生，管壁增厚，毛细血管腔狭小，GLP各组较DM组上述病理改变有不同程度改善。免疫组化结果免疫组化染色显示阳性颗粒要紧定位于肾小球和肾小管：DM组较C组比较，TGF-B、CO-N棕黄色颗粒染色强度明显升高，染色面积增多（P&lt;；GLP各组较DM组相较均不同程度降低（P&lt;。结果见表3及图loRT-PCR结果8周时，与C组相较，DM组TGF-BlmRXA、C0-IVmRNA表达增多；与DM组相较，GLP各组TGF-BlmRXA.CO-JVmRXA表达减少（P&lt;，见表3及图2。表3灵芝多糖对各组糖尿病大鼠TGF-P1和CO-IV表达的阻碍（略）4讨论本实验结果

15、说明STZ诱导的糖尿病大鼠模型，8周后大鼠显现毛色无光泽、生长发育迟缓等病症，BG、KI、HbAlc、UAER显著升高，病理上肾小球系膜细胞显著增生，系膜基质增多，肾小动脉内膜增生，管壁增厚，毛细血管腔狭小，提示已显现DN初期表现。GLP给药8周后糖尿病大鼠BW增加、KI降低，UAER指标明显改善，肾脏病理损害取得不同程度的改善，呈现剂量依托趋势，尤以灵芝多糖高剂量组明显。但对BUN、Scr、TC、TG无阻碍，这可能与糖尿病大鼠模型时刻较短，尚未显现全面的代谢紊乱有关。【参考文献】1林志彬.灵芝的药理作用A.林志彬.灵芝的现代研究,第2版M.北京:北京医科大学出版社,2001：219.2You

16、YH,LineffectsofGanodermalucidumpolysaccharidespeptideoninjuryofmacrophagesinducedbyreactiveoxygenspeciesj.ActaPharmacolSin,2002,23:787.3陈伟强，罗少洪，李红枝，等.灵芝多糖对高脂血症大鼠血脂及脂质过氧化的阻碍J.中国中药杂志，2005,30(17):1358.4ZeisbergM,Ericksen叫HamanoY,etexpressionoftypeIVcollagenisofomlsinratglomerularendothelialandmesangial

17、cellsj.BioehenBiophysResCommun,2002,295(2):401.5WangSN,Ramundfactoruhrafihrationinexperimentaldiabeticnephropathycontributestointerstitialfibrosisj.AmJPhysiol(Renalphysiol),2000,278:554.6 OkudaofTGF-betaintheprogressionofrenalfibrosisJ.ContribNephrol,2003,139:44.7DanielsMC,McClainDA,Crookregulationo

18、ftransforminggrowthfactorbetalbyglucose:investigationintotheroleofthehexosaminebiosynthesispathwayJ.AmJMedSci,2000,319(3):138.8PantsulaiaofTGF-betainpathogenesisofdiabeticnephropathyJ.GeorgianMedNews,2006,131:13.9ChenS,JimB,ZiyadehFN,etnephmpathyandtransforminggrowthfactor-beta:transformingourviewofglomemlosclerosisandfibrosisbuil