实验一淀粉酶产生菌的分离和酶活性测定-附件

1、YUNNAN NORMAL UNIVERSITY本科学生实验报告学号：124120463名:学院： 生命科学学院 专业、班级： 12 级生物技术班实验课程名称:酶工程实验一师:吴倩云南师范大学教务处编印实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定一、目的要求1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生 物。2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。二、基本原理一）淀粉酶产生菌的分离1. 菌种的采集 要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛 选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境

2、中采样即可。2. 富集培养 原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需 的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。3. 菌种的分离 淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物， 结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1. 原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与 3， 5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液 的颜色呈比例关系，可利用比色法在

3、540nm 进行测定。2. 酶活定义：在一定P H5.5、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1卩mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式：酶活（U/g） =A X 5X K X NX 1000/（TX W）A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子 1mmol=1000 molW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3 绘制标准曲线 先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波 长下分别测定它们的吸光度 A。 以 A 为横坐标，浓度 c 为纵坐标，则得到一条

4、拟合度较好的直线，称为标 准曲线。 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲 线上找出对应的被测溶液浓度或含量三、器材1试剂：可溶性淀粉、碘、碘化钾、 HCI、柠檬酸、Na2 HPO 4 12H2O等2培养基：分离、纯化培养基3仪器： 平皿、三角瓶、大试管、1mL和10mL移液枪、涂棒； 天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温 水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。四、操作步骤（一）淀粉酶产生菌的分离1. 培养基的配制及灭菌倒平板配制分离培养基=A高压灭菌30min '=A冷却至约50E 倒7块平板/140mL冷却备用2.

5、制备土壤稀释液 称取土样1g,放入9mL无菌水试管中，摇动10min,静置10min,制备得 到10-1 土壤稀释液； 用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分 混匀，制备得到10-2 土壤稀释液； 再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3 土壤 稀释液； 以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。3. 涂布用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6 和10-7 土壤稀释液各 0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。37C倒置培养23d（如发现4. 培养纯化 挑取其中透明圈

6、较大的单菌落，划线于平板， 杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养）。5. 产淀粉酶微生物的鉴定向平板内加入稀碘液数滴后进行观察（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制的配制：蛋白胨：0.7gMgSO4?7H2 :0.02g1. 淀粉酶产生菌的发酵酵母膏：0.7g CaCI2?2HQ : 0.08g分离培养基（140mL 可溶性淀粉：0.7gKH2 PO4 : 0.07g 琼脂 ：2.8g将纯培养得到的（透明圈 千50r/min摇瓶发酵约配置发酵培养基200mL/a（ 40mL/瓶）=A 最大的菌落接种于发酵培养基中30 E72h。2. 葡萄糖标准曲线的制作精确称取0.100g葡萄糖，用缓冲溶

7、液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml 的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示：0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖标准溶液 体积（ml）葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容总体积（ml）15151515151515OD( 540nm待测酶液的制备：a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件 4000转/5分钟，将离心后的上清 液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力b.底物溶液一2%£粉溶液（需当天配置）称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮

8、沸直到淀粉完全 溶解；冷却，并用缓冲液定容至100mL注：如果测定所得ODfi不在有效值（0.2-0.8 ）范围内，则相应地降低或增 大稀释倍数后再进行测定。 淀粉酶酶活测定方法操作步 骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL可溶性底物溶液吸取1.8mL可溶性底物 溶液吸取1.8mL可溶性 底物溶液步骤237 C保温5分钟37 r保温5分钟37 r保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫升加入待测酶液0.2 毫升步骤437 C精确保温15mi n37 r精确保温15mi n37r精确保温15mi n步骤5加入3mLDN试剂终止反应加入3mLDN试剂终止 反应加入3mLDN试剂终止反应步骤6混合

9、均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL混匀加蒸馏水10mL混匀加蒸馏水10mL混 匀步骤10OD540nm 匕色OD540nm 匕色OD540nm 匕色五、酶活测定注意事项注:1. 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；2. 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS时，枪头不要触碰管壁，也不 要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！3. 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；4. 避免试管进水：煮沸和用流

10、水冲洗时；5. 实验结果的记录与分析六、实验报告（一）淀粉酶产生菌的分离结果、筛选、果 稀释 倍数产淀粉酶菌落 数菌落形态透明圈大小10-36菌落疏松，呈绒毛状、絮 状、蜘蛛网状，大多为白色， 有的为淡黄色和黑色1.1cm,1.0cm0.9cm,0.8cm0.5cm,3cm10-41绒毛状，圆形，白色0.8cm10-51絮状，白色0.9cm10-61絮状，淡黄色0.5cm10-70（二）葡萄糖标准曲线绘制葡萄糖标准曲线的制作编号123456葡萄糖含量0.20.40.60.81.01.20D( 540nm0.0840.2850.4910.7180.9221.133糖化酶活力测定结果编号样品管A样

11、品管B0D( 540nm0.3320.289糖化酶活力的计算OD的平均值=(A+B /2=(0.332+0.289)/2=0.3105根据酶活计算公式：酶活(U/g) = (A X K+b) X N x 1000/(T x W)x 5A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率N :稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为 1 毫升体积T:反应时间(min)1000:转换因子 1mmol=1000 golW:葡萄糖的分子量(180.2g/mol)代入数据可得：酶活( U/g)=( (Ax K+b)x Nx1000/(TxW)x 5 =(0.3105x0.9479+0.126)x1x1000/(15x180.2) x5 = 0.77753、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。答：采集土样(除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm10cmt壤)将采集的土样进行 10 -1 10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的 植酸钙平板初筛培养基上，在 30r的恒温箱中培养3d,