口腔上皮基因组DNA与鉴定

1、海南大学农学院 09 级生物科学专业许连华 20090110310061人口腔上皮细胞提取基因组 DNA及 PCR-RFLP法鉴定CYP2C基因实验目的1、练习酚 - 氯仿法提取人的基因组 DNA2、掌握PCR法分离全基因组中特定基因的原理和方法3、熟悉RPLF法鉴定遗传多态性并掌握其鉴定基因型的原理实验原理1、酚-氯仿法抽提基因组DNA勺原理在EDTA存在下，用蛋白酶K消化细胞，用去垢剂溶解细胞膜，用酚抽提,除去杂蛋白、RNA及其他大分子，用异丙醇或乙醇沉淀可得到口腔上皮基因组DNA。2、PCR法分离基因的原理PCR即聚合酶链式反应的原理类似于 DNA的天然复制过程。在带扩增的DNA片段两侧

2、和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，DNA聚合酶以单链DNA为模板 利用反应体系中的dNTP按5't3方向经变性、退火和延伸若干个循环后,DNAT增 2n。3、RFLP的原理RFLP 即限制性内切酶片段多态性是基因型之间限制性片段长度的差异， 是 由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的。CYP2C9是细胞色素P450超家族的成员之一。是一类主要存在于肝脏、肠 道中的单加氧酶， 催化多种内外物质的代谢。 目前约有 16%的临床药物由 CYP2C9 负责代谢。CYP2C具有高度的多态性。T269C是位于CYP2C基因第二外显子的 一个多态位点。中国人群中大多数是纯合子，可被E

3、coRH内切,内切位点（ CTC/A）T269C CCTG咦变为本实验利用RFLP酶切GG387bp+302bp(GAC/T)C少数 CYP2C尸生突变。突变CTTGG EcoRH 内切产生三条片段 192bp+195bp+302bp 技术检测CYP2C的基因型。实验器材与试剂1 、器材1.5ml 离心管，系列移液枪，消毒棉签，恒温水浴锅，台式离心机，电泳系 统，PCF仪2、试剂人口腔上皮细胞，裂解液（150mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50），酚 氯 仿/异戊醇，20mg/ml蛋白酶K, 5MNacl, 70%S醇，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR 扩增体系(水 10 X

4、buffer dNT P Mgcl 2 Pf Pr Taq 酶)，Marker，酶切体系(10X buffer Bci130I )。四 实验步骤1、口腔上皮细胞基因组DNA提取取 1.5ml 离心管，加入 1ml 裂解液( 50mMEDTAPH8.0 950ul+10%SDS50ul )取消毒棉签在漱口后的擦刮，放入 1ml裂解液中洗脱加入20mg/ml蛋白酶K2.5ul，混匀，56° C水浴2h取新的 1.5mlEP 管加入 300ul 酚， 300ul 氯仿/异戊醇（ 24:1 ）取 800ul 上述裂解反应液加入试剂中颠倒混匀， 750g 离心 15min取上清，加入30ul

5、5M Nacl和700ul氯仿/异戊醇颠倒混匀，7500g离心15min取上清，加入0.6倍体积异戊醇，1200g离心15min,弃上清70%冷乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清，干燥。加15ml水溶解,并电泳检测。2、CYP2C基因的PCR扩增PCR扩增总体系：25ulH2O10 XdNT PMgcbPfPrTaq酶DNAbuffer(2.5mM(25mM)(1OuM)(1OuM)(5U/ul)15.5ul2.5ul2ul1.5ul0.5ul0.5ul0.5ul2ul电泳检测1%凝胶电泳检测。样品与 marker上样量各为5ul3 、CYP2C限制性长度多态性分析进行限制性内切酶酶

6、切，酶切体系：2ul 10 X buffer ,0.5ul 10M/mlBciT130l,17.5ul PCR 产物。体系总体积为20ul酶切1h,37 C水浴。4、电泳检测 电泳体系为：2%凝胶，maker5ul。五实验结果 本小组为第五实验组。基因组DNA第一次电泳检测。上下两排第一条带均为 Mark。每个实验小组点两个点样孔，从上排到下排，左到右一次点样。第五组点 样在下排，第五组电泳条带显示第五组基因组DNA提取失败。其中，第一组，第二组，第三组，第六组均显示条带，说明基因组 DNA提取成功。每排靠近点样孔处的亮点可能是杂蛋白或者其他杂质成分。DNA提取失败，PCRPCR条带外，还显示

7、了其他亮条带，可CYP2C9 PCR扩增电泳图上下两排第一条带均为 Mark。电泳点样同基因组 DNA电泳电泳顺序。由于基因组 也因此扩增失败。其他个别实验组扩增成功，显示亮条带。除了 能是引物二聚体或其他杂质成分条带。CYP2C9酶切电泳图上下两排第一条带均为 Mark。酶切电泳点样同以上两个电泳电泳顺序。本组实验失败。图中其他小组的 电泳条带均显示为双条带，说明在本班实验组提供基因的组员无CYP2C9突变。六实验分析与注意事项 分析已在各实验结果图处做了说明，因此此处略去，只写实验注意事项。注意事项:1、不同生物的基因组DNA提取方法有所不同,如植物基因组DNA提取常用CTAB法。2、组织

8、中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCF反应等有较强的抑制作用，故应先除去多糖和酚类物质。3、核酸通过有机溶剂抽提得以纯化， 污染的RNAS过RNA酶消化清除。并利用基因组DNA较长的特性在加入一定量的异戊醇或乙醇后，基因组的大分子DNA可沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，其他细胞器小分子DNA只形成颗粒状沉淀附 着于壁上及底部，从而达到提取的目的。4、在提取过程中染色体会发生机械断裂， 产生不同大小片段。所以操作过程尽 量温和且尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓。5、PCR缓冲液中含Tris/Hcl ，用以调节PH使Taq酶的作用环境维持偏碱性； 含Mgcl2,Mg2+影响Taq酶活性；含Kcl，

9、有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq 酶活性；含明胶，保护酶不变性。6、EDTA为金属螯合剂，可抑制DNA酶活性，防止DNA被降解。7、裂解液用以破膜，蛋白酶 K 56 C时活性最好，所以消化蛋白质时水浴温度 为 56C。8裂解后DNA漂浮于溶液上层，故再次抽提前取上清时要谨慎，少吸取一点, 不要取到中间层及下层物质。9、根据所提DNA量而定溶解水，一般为10-30ul，本次加水体积为15ul。10、BciT130l与EcoFffl是同工酶，本次酶切用的是 BciT130l。由于前者在购 买时商家比较多，出于试验成本等考虑而选用后者。失败可能原因：1、实验污染。2、操作太剧烈，机械损伤。3、酶活性在操作过程中收到破坏。4、试剂保存不当，失去效力。5、人为操作上的失误，如试剂添加顺序错误，取量过多或过少等。6、材料提取时，即刮口腔上皮细胞时没有刮到材料等。实验感想在实验操作中，练习了酚-氯仿法提取人的基因组 DNA还掌握了 PCF法分 离全基因组中特定基因的原理和方法，也学习了用RPLF法鉴定遗传多态性并掌 握了其鉴定基因型的原理，提高了对专业理论知识的认知以