第八章DNA 的构建

1、第八章 DNA 文库的构建 本章摘要 基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。按照外源 DNA 片段的来源，可将基因文库分为：基因组 DNA 文库（genomic DNA library）和 cDNA 文库（complementary DNA library）。基因文库构建的基本程序包括：1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 并反转录成 cDNA ；2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接

2、形成重组 DNA ；3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。cDNA 第二条链的合成在 cDNA 文库的构建中非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引导合成法，引物衔接头合成法可以合成 cDNA 第二条链。文库构建以后可以通过表型筛选法、杂交筛选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 第一节 基因组 DNA 文库的构建 基因组 DNA 文库：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。代表性和随机性 代表性是指文库中所有克隆所携带的 D

3、NA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。在文库的构建过程中引用了两个策略，一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出现的频率均等；二是提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark 和 Carbon 于 1975 年提出如下的计算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率f：表示重组克隆平

4、均插入片段的大小和基因组 DNA 大小的比值一、一、载体的选择 构建大片段基因组 DNA 文库使用的载体主要有 噬菌体（ phage）、粘粒载体（cosmid）、细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes, BAC）、酵母人工染色体 YAC（Yeast Artificial Chromosomes, YACs）、 P1 （Bacteriophage P1）和 PAC 。根据特征，这些载体可以分为两类，一类是基于噬菌体改建的，利用了噬菌体的包装效率高和杂交筛选背景低的优点；另一类经改造的质粒载体或人工染色体，其主要优点在于可容纳超过 100kb 以上的外源片

5、段。二、基因组 DNA 文库的构建流程基因组 DNA 文库的构建流程相对简单，但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备，尤其是构建插入片段较大的文库如 PAC 、 BAC 和 YAC 文库，其成功的关键都体现在操作的细节上。基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分： 载体的制备； 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的挑取和保存。图 8-1 为构建 BAC 文库的基本程序，

6、这一程序同样适合 Cosmid 文库、 PAC 文库和 YAC 文库的构建。构建噬菌体文库如 P1 等的程序稍有不同，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。图 8-1 ： BAC 文库的构建流程图1基因组 DNA 文库的载体制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。2高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的 35 倍。实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越

7、大。3文库的连接转化或包装侵染 一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。4文库的质量检测 在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一般要求植物的在 130kb 左

8、右，而动物的在 150kb 左右。插入效率也是通过此法检测的，表示有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程，一是计算法，基因组覆盖倍数平均插入片段长度克隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）；另一种算法是结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。三、重组体的筛选和分析（见本章第三节）。四、亚基因组文库

9、的构建第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。 cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。 cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬

10、菌体载体并导入宿主中繁殖。图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图 一、 RNA 的分离 cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA 中所占比例很小，因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低 rRNA 和 tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。 目前纯化 mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 oligo（dT）链，由它与 mRNA 的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将 mRNA 从其它组分中分离出来的。1mRNA 的完整性

11、指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力， mRNA 的大小，总 mRNA 制剂指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。 2mRNA 的丰度 高丰度 mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占 50-90% 。 低丰度 mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有 mRNA 。3mRNA 的富集 3.1 按大小对 mRNA 进行分级分离 3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大 mRNA ，可避免降解 mRNA , agarose 分离大小易辨。 3.3 多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。 免疫亲和柱/ A蛋白-Sep

12、harose 柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到 A 蛋白-spharose 柱上，随后用 EDTA 解离下来，通过 oligo（dT）层析分离 mRNA 。此法分离的 mRNA 只占总 mRNA 的 0.01-0.05% 。并非都可用，根据材料来源特异性来选择。 二、cDNA 第一链的合成 由 mRNA 到 cDNA 的过程称为反转录，是由反转录酶（reverse transcriptase）催化的。常用的反转录酶有两种，即 AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒），二者都是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，有 5-3 DNA 聚合酶

13、活性。合成 DNA 时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即 Oligo（dT）和随机引物。 Oligo（dT）引物一般包含 1020 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含 610 个碱基的寡核苷酸短片段。 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是在 cDNA 的合成过程中加入高浓度的 Oligo（dT）引物， Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存在较长的 pol

14、y（A）而影响 cDNA 测序。 随机引物引导的 cDNA 合成是采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5-端序列。随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。三、cDNA 第二链的合成 即将上一步形成的 mRNA-cDNA 杂合双链变成互补双链 cDNA 的过程。 cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物衔

15、接头合成法。1自身引导法（图8-3）： 首先用氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链，解离的第一链 cDNA 的 3-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导 DNA 聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用 S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。2置换合成法（图8-4）： 它是由一组酶共同控制，包括 RNA 酶 H 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 和 DNA 连接酶。 mRNAcDNA 杂合双链中的 mRNA 链在 RNA 酶 H 作用下先形成很多切口，

16、mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌 DNA 聚合酶 提供了合成第二链的引物。大肠杆菌 DNA 聚合酶 以第一链 cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而在 DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即 cDNA 的第二链。遗留在 5-末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆菌 DNA 聚合酶 的 5-3 核酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3-端部分序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 的 3-5 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的 3-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这种方法合成的 cDNA

17、 在 5-端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。 3引导合成法（图8-5） 本方法是 Okayama 和 Berg 1982 提出的。首先是制备一端带有 Poly（dG）的片段 和带有 Poly（dT）的载体片段 ，并用片段 来代替 Oligo（dT）进行 cDNA 第一链的合成，在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链 cDNA 的 3-端加上一段 Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在 RNA 酶 H 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 和 DNA 连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链 cDNA 。

18、其主要特点是合成全长 cDNA 的比例较高，但操作比较复杂，形成的 cDNA 克隆中都带有一段 Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。 图 8-5 ：引导合成法合成 cDNA 第二链 4引物衔接头合成法是 Gubler 和 Hoffman（1983）通过改进引导合成法而来的。第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链 cDNA 的 3-端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的 Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链，接头序列可以是适用于 PCR 扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成 PCR 法构建 cD

19、NA 文库的常用方法。四、双链 cDNA 连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖。 双链 cDNA 在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。1同聚物加尾（图 8-6） 该方法只对质粒有效，尾的长短不一（100dA/dT , 20dG/dC）。同聚尾结合的质粒： cDNA 杂合分子转化 E.coli 的效率随宿主不同而不同。2合成接头和衔接头（图8-7） 平端连接的效率低，加尾和加接头主要为了提高连接效率，其中添加带酶切位点的接头最为常用的方法。一种方式是单酶切位点连接策略，其在第一链合成时不引入接头，而直接在第二链上通过平端连接导入接头，当导入的粘端接头已经去磷

20、酸化，则可以分级分离后直接用于连接；当导入的粘端接头带有活性磷酸基团时，所加接头需选择甲基化敏感的酶且加接头之前必须对双链 cDNA 进行甲基化处理，加上接头后再用该酶进行消化，创造用于连接的粘端。另一种方式是双酶切连接的策略，一般在第一链合成时在 cDNA 的 5-端引入一稀有酶切位点，如 Not，在双链 cDNA 平端连接上带去磷酸化粘端的接头，如 Sal ，然后用 Not 酶切创造出另一端的粘端，这样可以与对应双酶切载体连接。同时，双酶切连接可以对插入的 cDNA 具有定向的作用。 3其他方法 3.1 mRNA-cDNA 杂交体克隆 合成第一链后, 通过末端转移酶加尾, 然后与带 dT

21、尾的载体退火，在宿主体内, 可除去 RNA , 代之以 DNA 。此方法无须合成第二链, 且序列完整，但效率低。 3.2 经典 RACE cDNA 克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长 cDNA 克隆。 cDNA 克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法获得 3 末端和 5 末端的序列。工作原理见图 8-8 、图 8-9 。筛选文库时一般只能回收一个或几个 cDNA 克隆， 而 RACE 可产生大量独立克隆。引物 GSP1 根据已经得到的不完整的 cDNA 的序列设计。8 ： 5-RACE 图 8-9 ： 3 RACE 3.3 新 RACE 五、 cDNA 克隆用的载体（见第三章）。第三节 基因克隆的筛选策略一般来说，这一筛选过程的难易程度，主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有以下几种：核酸杂交法，免疫学检测法。一、表型筛选法 对于生物的遗传来说，基因型决定表现型，也就是说，生物体的表型特征是由控制其性状的基