多聚赖氨酸的合成及其微结构对pH的响应_吴生蓉

1、网络出版时间：2013-04-10 15:42网络出版地址:DOI: 10.6023/CJOC201301066研究论文Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-1Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#ARTICLEChinese Journal of Organic Chemistry多聚赖氨酸的合成及其微结构对pH的响应吴生蓉，耿欣，陈才，蔡亦康，韩国志松（南京I业大学理学院南京，210009）摘要 以L-赖氨酸为起始原料，通过四步反应合成了多聚赖氮酸(Polylysm

2、e, PLL),采用红外、核磁对苴结 构进行了农征，并对关健介成环卩进行了优化.在此卑础上，通过扫描电傥和關二色光谱研究了多聚赖氨酸分子在 不同pH条件下的聚集行为.并对机制进行了阐述.研究结果表明，多聚赖妊酸结构对环境酸碱度冇不同的响应，不 同的pH条件下会9致不同的分子组装和形貌，心酸性条件下PLL呈现一种特宦的线圈形态：碱性条件下呈现有序 的松针状.关键词 梦聚輟氨酸；NCA;合成；pH;响应Synthesis of Poly-L-lysine and Its Structural Response toEnvironmental pHWu, Shcngrong Geng, Xin Ch

3、en, Cai Cat Yikang Han, Guozlii*(College of Science Nanjing Unn ersity of Technology. Nanjing 210009)Abstract Using L-lysine as raw material, Polylysme (PLL) was synthesized through four steps. The structures of intermediums and the final product were confirmed by IR and -NMR. Furthermore, some key

4、synthetic steps were optimized in the process. On the basis, response ability to environmental pH of PLL structures was investigated by SEM and Circular dichroism spectra. Experimental results indicated that Polypeptide stnichire of PLL have good response ability to pH of eavironinent. Under differe

5、nt pH conditions, distinct morphology was fbnned. Under acidic conditions, PLL presented a specific coil conformation, whereas orderly pine needle was observed under alkaline conditions.Keywords PLL; NCA; Synthesis： pH; Response E-mail: hannjut 1Januaiy 25,2013; March 15,2013; Apnl 9,2013.Project su

6、pported by Cluna Postdoctoral Foundation (Nos 20100481084 ) 中国博士JR基金(201001810S4)资助.© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究论文ARTICLE0HNH： HC12.Na2S1 CuSO4.Z-ClZ-groupol.HCl(g)2HBr(g)Chinese Journal of Organic

7、 Chemistry炙聚赖氨酸(PLL)作为一种亲水性的生物町降解人分子，对生物无毒副作用，只令良好的生物相容性.氏可以通过生物内的水解或者稍解反应降解为小分子麺基酸，被生物体所吸收也可以通过细胞内吞作用进入 细胞因此，广泛W用医学丁程领域如药物控释、组织丁程、基因治疗等方面，PLL侧链的NH功能甚团在 被修饰材料衣面形成阳离子层，易与细胞膜或组织切片上的阴离子静电吸附，产生较强的粘介力，C被广泛用 J：商品化细胞培养版的表而处理，以促进细胞在材料衣面的黏附和生长，貝冇广阔的科硏与应用前景卩却多聚赖 氨酸中的多肽结构对多聚赖氨酸长链结构排列形态也令着帀:要的影响，使得多聚赖氨酸在分子组装与界面

8、修饰 领域也受到关注【同I前关多聚赖氨酸介成以及其结构功能特性的相关报道较少，ifuHM些关键点的讨论不 是很清晰棊以上问题，本文以L赖氨酸为原料，通过氨基保护，环合，开徒聚合、脱保护四步反应介成了多 聚赖氨酸，并对其屮某些关键步骤进彳J：了优化研究在此妹础上，通过打描电镜、関二色光谱研究了务聚赖氨 酸在不同pH条件卜的微观形态，并対机制进行了阐述对J： PLL应用功能界面修饰JI仃较好的指导意义.1结果与讨论1.1合成条件的优化赖氨酸!I仃两个氨堆，在合成幺聚赖氨酸的过程中，要对其中一个不需要反W的氨堆进行保护，避免副反应的发生E.然后经环化、聚合、脱保护得到目标产品.合成路线如图1所示.C

9、hin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究论文Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#DOI: 10.6023/CJOC201301066研究论文图1多聚赖氨酸的合成路线图Figure 1 Synthesis route of PLL1.1.1氨基的保护Chin. J. Org. Chem. 2012. 32,xxxx -xxxxhttp:/sioc-#Chinese Journal of Organic Chemist

10、ryARTICLE在多聚赖氨酸的合成过程屮，常用的氨垄保护策略是将氨基酸屮的氨卑及U-馥基与铜盐形成氨基酸铜络 介物，在侧链上引入保护基之后，再脱除铜离了，得到侧链保护的氨垄酸x°:.传统方法中，选择的铜盐圧碱式離酸 铜，但试验中发现，碱式碳酸铜4冰中溶解度较小，导致氨基酸与铜盐络合收率较低文中采用硫酸铜，不仅收率 簡，而11反咸Z后无须过滤，可直接进行后续氨卑Z-保护反应，简化了实验操作.在脱除铜离了环节，本文研究了 四种试剂，分別足EDTA、HS、硫代硫酸钠、硫化钠.试验中发现EDTA去除铜离子受pH影响很大：叫 收率较低, 只有45%.H2S气体操作起來比较麻烦Na2S2O3脱

11、除效率也偏低.文中选择Na2S脱铜离子，收率较高，达到70%, 而II易于分离.1.1.2 N节氧按基丄赖氨酸N拔酸軒（Z丄-Lys NCA）的合成在本步反应中，采用三光气替代光气，安全高效.三光气在一定温度下可定星分解产生三分子光气，三光 气对水分比较敏感，本文选择温度在5060C之间，采用氮气保护.实验中发现温度对该反应的收率冇较大的影响， 随着温度从50 C升高到60 C,收率从97%降到73%,如图2所示.可能是升高温度使其分解加速，部分光气來不及 反应而逸出.70605058525456Temperature (°C)http:/sioc-3© 2012 Chin

12、ese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE图2 NCA产率与温度的关系Figure 2The relationship between the NCA yield and temperature1.1.3 Z-L-Lys NCA 的聚合该聚介反应圧开环聚介，机理上属于阴

13、离子聚介权，如图3所示.Chin. J. Ora. Chem. 2012. 32XXXX XXXXhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE0图3 NCA聚介机理Flgure3 NCA polymerization mecliamsm本文以三乙胺为引发剂，氮气保护下引发NCA进行开环聚介.并研究了引发剂的量对聚介物分子量的影响.分子就的测定采用粘度法先测定1%PLL试样的増比黏度nsp,并根据卜式计算聚合度DP(degree

14、 of polymerization)*1Log DP= 0.791og n sp+2. 46结果如表1所示表1引发剂用量对PLL分子量的彩响Table 1 Influence of amount of uutiator on PLL molecular weightnspDPMq1:10.46681582306825:10.839425136646100:10.844525236844150:11 923148370585实验结果显示引发剂用戢金一定范用内对PLL分子就的影响较大当单体与引发剂的比例从50:1増加到100 E 粘均分子虽:从36844增加到705 P(NCA)

15、的脱保护P(NCA)脱保护妹团通常自pdC催化卜的还原、HBr HAC, Na/液氮.議渓酸/三氟乙酸等体系本文用了4http:/sioc-http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE两种方法脱Z保护皋团，一种是采用HBr/HAc体系；另一种是迪入HBr(g).HCl(g),从实验结果來看，第种方法 得到的产物7. 5ppm处芳环质子邯消失，说明节氧碳难已脱除干斤，而第一种方法得到的产物7. 5ppm处冇微谢的出 峰,说明第种

16、方法效果较好.(见support information)1.2多聚赖氨酸微观结构对pH的响应由于PLL的多肽特性，外界环境pH的变化会对其会发工-个质了-化的过程.在酸性条ft F,侧链氨基获 得H形成带止电荷的-NHJ,具备较强的亲电性，碱性条件卜，氨皋是典熨的亲核试剂.因此，/I： PLL大分子的组装 过程中，酸碱性的改变必然对分了的聚集行为产生影响.本文采用打描电镜研究了不同pH条件下PLL的圉观形貌, 图4是不同pH条件下，PLL溶液在棊片匕自然挥发干后的扫描电镜图.http:/sioc-5© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC

17、. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE图4 不同pH条件FPLL的打描电镜图(a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7Figure 4 SEN1 unages of PLL witli different pH (a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7从图中明显看出，不同酸碱性条件

18、下，PLL的形貌截然不同.在酸性条件下，其形貌呈现种特怎的线圈构彖(coilconfoniiation),随着pH的増加，逐渐向淸晰的松针状转变.在酸性条件下，侧链氨基较强lE电性，使得其分 了长链的聚集趋向一种无圧的排列，以减轻内部的排斥力.宏规上丧现为一种线圈构彖.随着pH的升高.侧链氨垄逐 渐向弱的亲孩试剂转变，PLL主链依靠链内包键盘绕成稳定的螺旋结构，图5足此过程的示意图.(I)(II)http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic Chemistry

19、ARTICLEPH<7PH>7图5 PLL结构随pH转化示意图Figure 5 Sketch map of PLL structure transfoniiation with different pHChin. J. Org. Chem. 2012. 32xxxxxxxxhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE为了进一步验ilE PLL微观结构转化与pH Z间确泄的关联，本文忡先测试了不同pH条件卜PLL水溶

20、液的闘二 色光谱，如图6所示.实验结果显示，不同pH条件下，PLL溶液的岡二色光谱基本一致这说明不同的pH条件， 不会彩响PLL分子的立体构形.- - - -2,-6 (6®pe0。http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic Chemis

21、tryARTICLE2008250300350400Wavelength( nm)图6不同pH条件下，PLL溶液的圜二色光谱Figlire 6 CD curve of PLL solution with different pH然后本文将不同pH条件下的PLL溶液冷冻干燥，再次观测其微观形貌如图7所示.图7不同pH条件下PLL溶液冻干后的扫描电镜图(a) PH<7 (b) PH=7 (c) PH>7Figure 7 SEM ullages of PLL ria &eezedrying witli different pH conditionshttp:/sioc-#

22、9; 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLEhttp:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE从图中明显看出,在酸性条件下,PLL溶液中分子的聚集结构显得无序.随着pH的增加，在緘性条件下,PLL 分子的聚集行为变得较为仃丿仇综I:所述，PLL分子的聚集行为对环境酸碱度仃着良好的响应.6http:

23、/sioc-http:/sioc-#© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC. CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE2结论本文以L赖氨酸为原料，研究了多聚赖基酸的介成，并对介成环节进行了详细的分析与优化.任此基础上，本 文暇点研究了务聚赖氨酸的分子聚集组装行为与环境pH值之间的关系，发现不同的pH会导致多聚赖氨酸分子不同 的分子组装彳J为，工现不同的微观形貌，并对机理进行了阐述对于多聚赖氨酸在界面科学应用方面具彳一定的指 导意义.3实验部分3.1仪器与试剂仪器：数字显示熔点测定仪，X-

24、4型(上海粘密仪表公司)：核磁共振仪，Bniker av-500型，TMS为内标，以CDC13 或DMSOd为溶剂;红外光谱仪,Nicolet FIR-360 (美国Thermo Nicolet公司):圆二色光谱仪,佳司科J-810 ( H 本分光株式会社)：扫描电镜,Zeiss Ultra Plus (徳国卡尔蔡司公司)；旋转粘度讣,NDJ-5S (上海伦捷机电仪表 有限公司)：循环水式多用貞空泵，SHZ-III (南京科尔仪器设备冇限公司)；冷冻干燥机，FreeZone 6升复栓制 冷型(美国Labconco公司).试剂：L-赖氨酸盐酸盐，氯甲酸节酯(阿拉丁，AR):三光气(安耐吉化学,A

25、R):硫酸铜，硫化钠(无锡亚盛化 E,AR):氢澳酸,硫酸(上海凌峰,AR),其它试剂均为市售分析纯.3.2实验方法3. 2. 1氧按基-L-赖氨酸的合成(e -Z-lys)称取20g L-赖氨酸(134mmol),适量劇水加热使之稱解,然后加入16.5g硫酸铜(66mmol).回流2K 然后冰浴条件下，分批加入25g (147niniol)氯甲酸节酣，任此过程中，通过加入碳酸卷钠保证溶液的PH在89之 间，搅拌过夜.过滤.沉淀用履蚀水、乙醇洗涤干燥丿E得到4 1?g (49mmo1)蓝色的N'-茱氧按鬼-匸-赖氨酸铜 盐络介物(I ).收率96%.将中间体(【)加热分散于蒸懈水中，分

26、批加入NaS,至溶液蓝色消失为止.过滤除去黑色 的硫化铜沉淀，将滤液的pH值调至3-5之间，有大屋白色沉淀析出，将沉淀过滤，乙醇重结晶，貞空干燥得到25.6g (90inmol)N -Z-lys ( H )产率 65.43%.m.p.： 250-255°C;】H NMR (DMSO,500 MHz)： 6: 7.19-7.37 (nrCSH), 5.0(s;PhCH2,2H), 3.74(t; a -CH) 3.29 (m; e -CH2), 1.72(m;-CH2), 1.30-1.39(m; Y -CH：和 6 -CH:) IR (KBr) v: 3345 cm1 (s; NH/

27、OH)和1691cn/(s：节氧按堆上的C=O )3. 2.2 N £赖氨酸竣酸用' LysNCA的介成称取4g(14mmol)II,加入40mlTHF, 55*C水浴下，氮气保护下慢慢滴加2g (7mmol)三光气的THF溶液， Z后继续反应2h,溶液逐渐变得澄淸透明.Z后继续通-段时间氮气，以排出多余的光气.TLC监控反应终点.然后 适当浓缩,加入正己烷使产物析出,过滤,干燥，得到3.8g(12mmol) Lys(Z)-NCA (III),产率89.7%, nip.： 98-101 *C,】H NMR (CDClj, 500 MHz)： 6: 7.257.36(m:C6H

28、5)629 (s;NH),5.08-5.14(s;PhCH;),4.83(bs;NH), 4.28(t; « -CH),Chin. J. Org. Chem. 2012. 32、xxxx -xxxxhttp:/sioc-7© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE3.17-3.26 (m; £ -CH2), 1.84-1.99(m; P -CH:), 1.26-1.58 (m; Y -CH2 和 6 -CH" IR (K

29、Br) v:3342cm1(s;NH),1856/1837/1813cni1(s;NCA 上的 C=O),1774cm l(s; NCA 上的 N-C=O) , 1689cm 】(s;节氧琰基上的 C=O)3. 2.3 Lys( Z)-NCA 的聚合将2g (6. 5mmol)NCA溶于1 OOmlDNlF, N2的保护下，加入引发剂三乙胺(单体/引发剂 =1/100),室温下搅 ft 72h.之汗将溶液倒入大鼠蒸溜水中，静置，沉淀析出，过滤，干燥，得到P(NCA) 0 075g(2.04nniol),产率37.53%. 】H NMR (DMS0.500 MHz)： 6: 7.96(s;-NH

30、-Z), 7.27(m:C6H5CH:, 5H). 5.0(s;-CO-CH-NH-),3 58(s; a -CH),2 96(m;-CH:), 1.03-1.38 (m.-(CH2)3 -CH：-NH-Z) IR (KBr)v: 3287cm'1(s;NH).1690cm'1(s;卡氧按基上的 C=0), 1652 cm l(w; I NH2), 1543 cm4(w. IINH2)3. 2.4聚赖氨酸的制备取lg(27nmol)P(NCA)溶于二恶烷和氯仿的混介溶剂中，通入无水氯化氢，一段时间后，通入无水汉化抵，溶液 产生沉淀氮气保护下，室温搅拌2h,将反应好的溶液倒入冰乙

31、魅中萃取，水柑用盐酸调PH到3左右，然后用透 析袋纯化24h(vs001MHCl),后进行冷冻干燥，得到0.4201g(l 1.46mnol) 色的聚-L 赖氨酸，收率52.51%H NMR (DMS0.500 MHz)： 6: 3.33 (t: a -CH). 2.49-2.77(t. e -CH2), 1.61 (m; P -CH2 fH o-CH2). 1.38(m： Y -CH:) IR (KBr) v: 3278cm4 (s;NH),1653cn/(w; I NH2),1532 cm l(w; IINH：)3. 2.5多聚赖毎酸pH响应分析将适最的多聚赖氨酸溶于蒸懈水中，分置三个棕色

32、瓶中.用盐酸将其pH值分别调成酸性，中性、緘杵，首先分 别测试其関二色光谱.然后用移液枪分别取3mL滴在干净的玻片衣曲，待其门然风干后，采用扫描电镜观测莫形貌. 最肩将剩下的溶液冷冻干燥，再次采用扫描电镜观测其形貌.致谢：木论文的部分实验测试匸作得到J'南京东纳牛物科技有限公司的支持，©此表示感谢.辅助材料(Supporting Information)实验部分介成中间体的核磁、红外-这些材料可以免费从本刊网站 (http:/sioc-Refere nces1 Kito YHiramot S; Miirao M;Hono Y;Miyazaki T:Kodama T:Hakab

33、ou Y.The Journal ofNutiition lWy. 133(6): 1887.2 Quirk RA.Chan WC,Davies MC,et al. Bioniaterials 2001:22(8):865-872.3 Stq3haiue andeVondele ;Janos Vords. Jeffrey A Hubbeli.Biotechnol Bioeng. 2003: 82(7): 784-790.4 Hiraki J. Fine Chemical.29(6): 18.r5Guo,Yia,F;Xu.L;Li,J;Yang,W-S;Jiang.LZaMir.2010, 26

34、(2). 1024.©2012 Chinese Chemical Society & SIOC, CASChin. J. Org. Chenk2O、2,32http:/sioc-xxxxxxxxChin. J. Org. Chem. 2012. 32、xxxx -xxxxhttp:/sioc-9© 2012 Chinese Chemical Society & SIOC CASChinese Journal of Organic ChemistryARTICLE6 Wang, Y.; Cliang, Y. C Macromolecules.!. 36, 65

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