教学课题血红蛋白的提取和分离

1、教学课题： 血红蛋白的提取和分离 课 型：复 习 考试要求：1.简述蛋白质提取和分离基本的原理。（A级） 2.尝试蛋白质的提取和电泳分离。（A级）教学重点：凝胶色谱法的原理和方法。教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。基础知识梳理与例题解析一、蛋白质的分离方法1、蛋白质分离的依据：蛋白质各种特性的差异，如分子的 、所带电荷的 、 和 等。2、分离方法： （1）凝胶色谱法 概念：也称 法，是根据 分离蛋白质的有效方法。所用材料：凝胶是一些微小多空球体，大多数是由 构成的，如 或 。分离的基本原理：当蛋白质通过凝胶时，相对分子量不同，其通过的速度也不同。 相对分子量较 的蛋白质容

2、易进入凝胶的内部，路程 ，移动速度 ； 相对分子量较 的蛋白质无法进入凝胶的内部，路程 ，移动速度 。 在层析柱中先洗脱下来的是相对分子量较量 的蛋白质。（2）、电泳法：概念： 的过程。原理：一些生物大分（如 、 等）子，在一定pH下，其 会带上正电或负电，在电场作用上这些带电分子会向着 的电极移动。因各种分子 的差异以及分子本身 的不同，迁移速度不同，从而实现各分子的分离。常用方法： 电泳和 电泳。在测定蛋白质分子量时，通常使用 电泳。例题1凝胶色谱法分离蛋白质的依据是 （ ） A.对其他分子的亲和力 B.溶解度 C.所带电荷多少 D.相对分子质量的大小例题2凝胶色谱法中所使用的凝胶化学本质

3、大多是 （ ） A.糖类化合物 B.脂质 C.蛋白质 D.核酸例题3利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来 （ ） A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子质量小的 D.所带电荷多的二、蛋白质的提取和分离过程蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、 、 和 。1、样品处理（1）红细胞洗涤 目的： 方法：分离（ 离心） 吸去上层透明 下层暗红色的 液体用 倍体积的 洗涤 搅拌、 离心（重复 次，直至 ）（2）血红蛋白的释放目的： 方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加 到 的体积，再加 体积的甲苯，置于 上充分搅拌10min (3)分离血红蛋白溶液方法: 速度： 时间： 结果： 注意：红细

4、胞的洗涤的注意事项 洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度 和时间 会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的要求。2、透析-粗分离目的：除去样品中分子量 的杂质或用于更换 。原理：透析袋能使 自由进出，而 保留在袋内。例题4选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处 （ ） A血红蛋白是有色蛋白 B红细胞无细胞核 C红细胞蛋白质含量高 D红细胞DNA含量高例题5下列有关血红蛋白透析过程叙述中，错误的是 （ ） A.透析袋一般是用硝酸纤维素制成的 B.透析袋能使大分子蛋白质析出，得到纯化的蛋白质液 C.透析袋需放入磷酸缓冲液中透析12 h D.透析的目的是去除样品中较小的杂质3、凝胶色谱操作样品的纯化（

5、1）凝胶色谱柱制作：制作成功与否的标志： （2）凝胶色谱柱的装填填充材料：交联葡聚糖凝胶方法：固定：将色谱柱 固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液 装填入色谱柱内洗涤：用 充分洗涤平衡凝胶12h(3)样品的加入和洗脱：调整缓冲液面：与 面平齐 滴加透析样品：用量为 mL样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层 洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱收集：待 的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 mL一试管，连续收集4、SDS聚丙烯酰胺电泳纯度鉴定（1）蛋白质纯度鉴定的目的： （2）蛋白质纯度鉴定的方法：使用最多的是 注意事项：色谱柱填料的处理干燥凝胶加速膨胀的方法： ；这样不但节约时间，而且可以

6、除去 ，排除 。凝胶色谱柱的装填：装填的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填时不得有气泡存在，因为 。例题6凝胶色谱柱的装填是凝胶电泳非常关键的步骤，凝胶的装填要紧密和均匀的主要原因是（ ）A.使凝胶充分吸水 B.阻挡大分子蛋白质析出 C.防止气泡在色谱柱内形成无效的空隙 D.降低洗脱速度例题5下列有关血液成分的描述中,正确的是 ( )A.血液由血清和红细胞组成,其中红细胞最多B.在红细胞的组成中,约90%的是血浆蛋白C.血红蛋白由4个肽链组成,包括2个-肽链和2个-肽链 D.血红蛋白的每条肽链环绕一个亚铁血红素基团,只能携带氧气例题6将洗涤好的红细胞倒入烧杯中后,为了促使红细胞破

7、裂,释放出血红蛋白质,需加入的物质是（ ） B.3.0g的柠檬酸钠 C.蒸馏水和40%体积的甲苯 D.20mol/L的磷酸缓冲液例题8在凝胶色谱柱中加入样品和洗脱的步骤中，下列操作错误的是 （ ） A.加样前，打开色谱柱下端的出口，使柱内面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐， B.将透析后的样品回到色谱柱的顶端，加样后打开下端出口 关闭出口 C.等样品完全进入凝胶层后关闭下端出口 D.用吸管将缓冲液加入凝胶柱，打开下端出口，进行洗脱例题9凝胶色谱柱的装填是凝胶电泳非常关键的步骤，凝胶的装填要紧密和均匀的主要原 A.使凝胶充分吸水 B.阻挡大分子蛋白质析出 因是（ ） C.防止气泡在色谱柱内形成无

8、效的空隙 D.降低洗脱速度反馈练习蛋白质的提取和分离一般分为四步，下面顺序正确的是 （ ） A.样品处理 纯化 粗分离 纯度鉴定 B.粗分离 样品处理 纯化 纯度鉴定 C.样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 D.纯化 粗分离 样品处理 纯度鉴定下列有关缓冲液的叙述中，不正确的是 （ ） A.缓冲液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B.缓冲液通常由1种酸性或1种碱性物质单独配制而成 C.人体血液中有调节pH的酸碱缓冲对 D.调节缓冲剂的使用比例就可以制得不同pH范围使用的缓冲液下列有关电泳原理的叙述中，正确的是 （ ）A.电泳是电子在电场作用下发生跃迁的过程B.许多生物大分子如

9、多肽、核酸等都可以在一定的pH下，进行电泳实验 C.在电场作用下，带电分子会向与其所带电荷相同的电极移动 D.电泳的过程通常在蒸馏水中完成将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其 中第3层是 （ ）A.无色透明的甲苯层 B.脂溶性物质的沉淀层 C.血红蛋白的水溶液 D.其他杂质的暗红色沉淀物凝胶色谱法操作正确的是 （ ） A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B.将橡皮塞下部切出凹穴 C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片对血红蛋白的研究结果表明，血红蛋白实际上是由珠蛋白、原卟啉和二价铁离子（Fe2+）所组成

10、的结合蛋白质。有4条肽链各结合一个辅基即血红素，O2结合于Fe2+上，血红蛋白与氧疏松结合形成氧合血红蛋白(HbO2)，这种氧合作用于氧分压高时容易进行，于氧分压低时易于解离。红细胞结合和携带O2的过程并不影响二价铁离子，也就是说不使之氧化为三价铁离子（Fe3+ 无携带O2的能力）。CO与Hb的亲和力大于O2，结合成CO后不能重新分离，致使Hb丧失运输O2和CO2的机能，此称一氧化碳中毒即煤气中毒。（1）用凝胶色谱法分离出血红蛋白时，待 接近色谱柱底端时，才用试管收集。血红蛋白因含 而呈现红色。（2）要使血红蛋白从红细胞中释放出来，可选用的方法 。（3）红细胞具有运输氧的功能，是因为具有 的特性。（4）亚硝酸盐