脲酶Km值的简易测定精_第1页
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文档简介

1、实验九 脲酶Km值的简易测定 目的和要求掌握测定米氏常数的原理和方法，学习并掌握一般的数据处理方法 原理NH2脲酶+(NH4)2CO33NH2(NH 4)283 + NaOH + ( KI ) 2HgIO、NH 2IHg（橙黄色）步骤1 脲酶的提取：称取大豆粉 1克，加入30%的乙醇25mL充分摇匀后，置于冰箱中过夜, 次日用2000rpm离心3分钟，取上清液备用。2 标准曲线的制作：按下表加入各种试单位：mLAvV 口吕号硫酸氨蒸馏水氢氧化钠酒石酸钾钠奈氏试剂105.80.20.51.020.15.70.20.51.030.155.650.20.51.040.205.60.20.51.050

2、.255.550.20.51.060.305.50.20.51.0立即摇匀各管，于 460nmra 口_r r 下比色，1号吕为参比。3 酶促反应速度的测定：按下表操作单位：mL管尿素浓尿素加磷酸保温脲酶煮沸保温硫酸蒸馏水氢氧号度入量缓冲时间加入脲酶时间锌化钠液量10.0500.200.6037度0.20/37度0.503.00.520.0330.200.60水浴0.20/水浴0.503.00.530.0250.200.60保温0.20/保温0.503.00.540.0200.200.605分0.20/10分0.503.00.550.0200.200.60钟/0.20钟0.503.00.5摇匀，静置5分钟后，于3000rpm离心5分钟，取上清液，供下步使用。单位：mLAvV 口吕号上清液蒸馏水酒石酸钾钠奈氏试剂12.04.00.501.022.04.00.501.032.04.00.501.042.04.00.501.052.04.00.501.0迅速混匀，于460nm处测吸光度，5号为参比4 从标准曲线方程中脲酶作用于不同浓度尿素生成碳酸铵的量，然后以取单位时间碳酸铵生成量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的尿素浓度的倒数即1/S为横坐标，应用最小二乘法公式，求出方程，计算Km值

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