血清免疫球蛋白的提取分离纯化及鉴定

1、I 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘 膜和肌肉等组织， 也选用全血、 血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品， 有时也采用尿液、 胃液等完成各种生化实验。 掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺 利进行的关键。一、血液样品（一）采血因此时血液中化学成分含量比较稳接血时应让血液沿着容器壁慢慢注制备方法是： 将刚采集的血液直接测定用的血液， 多由静脉采集。 一般在饲喂前空腹采取， 定，采血时所用的针头、 注射器，盛血容器要清洁干净； 入，以防溶血和产生泡沫。（二）血清、全血及血浆的制备1. 血清的制备 血清是全血

2、不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。注入试管或离心管中。将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经 3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入 37 C恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。为了缩短时间，也可用离心机分离 （未凝或凝固的均可离心） ，分离出的血青， 用吸管吸出置于另一试管中， 若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。2. 全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器， 收集动物的新鲜血液， 立即与适量的抗凝剂充分混合， 所得 到的抗凝血为全血。 每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。将已抗凝的全二于2， 000r

3、 / min 离心 10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。 血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比 血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。3. 抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。 抗凝剂种类甚多， 实验室常用的有如下 几种，可根据情况选择使用。（1）草酸钾（钠） 优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血 液不凝固。每毫升血液用 1-2mg 即可。配制方法：配制 10草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 C烘箱烤干（若超过 150 C则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞

4、备用。可抗凝血液 5ml 。此抗凝血， 常用于非蛋白氮等多种测定项目， 但不适用于钾、 钙的测定。对乳酸脱氯酸性磷 酸酶和淀粉酶具有抑制作用，使用时应注意。（ 2）草酸钾 -氟化钠氟化钠 是一种弱抗凝剂。但浓度 2mg / ml 时能抑制血液内葡萄糖的分 解，因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用。配制方法：草酸钾6g、氟化钠3g,溶于100ml蒸馏水中。每个试管加入0.25ml,于80C烘 干备用。每管含混合剂 22. 5mg，可抗凝5ml血液。此抗凝血， 因氟化钠抑制睬酶， 所以不能用于脉酶法的尿素氮测定； 也不能用于淀粉酶及磷 酸酶的测定。（3）乙二胺四乙酸二钠盐（简称有效浓度为 0.5mg

5、 可抗凝 lmlEDTANa2 ) EDTANa2 血液。易与钙离子络合而使血液不凝。配制方法：配成 4 % EDTANa水溶液。每管装 O.lml , 80 C烘干，可抗凝5ml血液。此抗凝血液适用于多种生化分析。但不能用于血浆中含氮物质、钙及钠的测定。(4) 肝素 最佳抗凝剂，主要抑制凝血酶原转变为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋 白而凝血： 0.1 -0.2mg 或 20 单位可抗凝 lml 血液。配制方法：配成10mg /ml的水溶液。每管加 0.1ml于37-56 C烘干，可抗凝5-10ml血液 (市售品为肝素钠溶液，每毫升含 12,500 国际单位，相当干 100mg ，故每

6、125 国际单位 相当于 lmg )除上述抗凝剂外，还有柠檬酸钠、草酸铵等，因不常用，故不作介绍。(三) 无蛋白血滤液的制备 测定血液或其它体液化学成分时， 样品内蛋白质的存在常常干扰测定。 因此， 需要先做成无 蛋白血滤液再行测定。无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白， 用过滤法或离心法除去沉淀的蛋 白。现介绍几种常用的方法：1. 钨酸法原理： 钨酸钠与硫酸混合，生成钨酸：Na2WO4 + H2SO4 宀 H2WO4 十 Na2SO4血液中蛋白质在 pH 值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀： 沉淀液过滤或离心， 上清液即为 无色而透明、 pH 约等于 6 的无蛋白滤液。可供非蛋白

7、氮、血糖、氨基酸、尿素、尿酸及氯 化物等项测定使用。制备方法：(1 )取 50ml 锥形瓶 1 只，加入蒸馏水 7 份；( 2)用奥氏吸管吸取抗凝血1 份，擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。 放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹 入，反复洗管 3 次。充分混合，使红细胞完全溶解； ( 3)加入 0.333mol/l ，硫酸溶液 1 份， 随加随摇，充分混匀，此时血液由鲜红变成棕色，静置 5-10min ，使其酸化完全； (4) 加入 10 钨酸钠 1 份，随加随摇； (5)放置约 5min 后，如振摇亦不再发生泡沫，说明蛋白质 已完全变性沉淀。用定量滤纸过滤或离心( 2,50

8、0r/min , 10min) ，即得完全澄清无色之无蛋 白血滤液。用此法制得的无蛋白血滤液为 10 倍稀释的血滤液。即每毫升血滤液相当于 0.lml 全血。 试剂： (1) 10 钨酸钠溶液( 2) 0.333mol/L 硫酸溶液2. 氢氧化锌法原理：血液中蛋白质在 pH 大于等电点的溶液中可用 znZ 十来沉淀。生成的氢氧化锌本身 为胶体可将血中葡萄糖以外的许多还原性物质吸附而沉淀，所以此法所得滤液最适作血液葡萄糖的测定(因为葡萄糖多是利用它的还原性来定量的)。但测定尿酸和非蛋白氮时含量降低，不宜使用此滤液。制备方法： (1)取干燥、洁净的 50ml 锥形瓶或大试管 1 支，准确加入 7

9、份水； (2)加入混 匀的抗凝血 1 份，摇匀；(3)加入 10 硫酸锌溶液 1 份，摇匀；(4)慢慢加入 0.5mol / L 氢 氧化钠溶液 1 份，边加边摇，放置 5min ，用定量滤纸过滤或离心( 2,500， 10min ) ，除去 沉淀，便得到完全澄清的无蛋白血滤液。此滤液亦为稀释10 倍之血滤液。试剂： (l) 10 硫酸锌溶液( 2) 0.5mol / L 氢氧化钠溶液3. 三氯醋酸法 原理：三氯醋酸为一有机强酸，能使蛋白质变性而沉淀。制备方法：取 10 三氯醋酸 9 份置于锥形瓶或大试管中，加 1 份已充分混匀的抗凝血液。 加时要不断摇动， 使其均匀。 静置 5min ，过滤

10、或离心。 即得 10 倍稀释之清明透亮的滤液。或者从组织中分离、二、组织样品 在生化实验中， 经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。 纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。但是，在生物组织中， 因含有大量的催化活性物质， 离体组织的采集必需在冰冷条件下进行， 并日需尽快完成测定。 否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。 一般采用断头法处死 动物， 放出血液，立即取出所需脏器或组织， 除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血 液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。组织 匀浆： 取

11、一定量新鲜组织剪碎， 加入适量匀浆制备液， 用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨 碎组织。 由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量， 因此在制备匀浆时， 需将匀浆器置于 冰水中。常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和 0 .25mol/L 的蔗糖液等，可根据实验的要求，加 以选择。组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。II 蛋白质的沉淀反应1实验原理在水溶液中， 蛋白质分子表面结合大量的水分子， 形成水化膜， 同时蛋白质分子本身带有电 荷，与溶液的反离子作用，形成双电层， 因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。 整个 蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。 当某些物理化学

12、因素导致蛋白质分子失去水化膜或 失去电荷， 甚至变性时， 它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出， 这就是蛋白质的 沉淀作用。蛋白质的沉淀作用分为两类：1）可逆沉淀作用 在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变， 仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素， 蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。 因此，这 种沉淀作用称为可逆沉淀作用。 属于此类的有盐析作用， 低温下丙酮、 乙醇使蛋白质沉淀的 作用， 以及利用等电点的沉淀。 盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在 高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。同时蛋白质分子所带的电荷被中和， 因

13、而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素， 使蛋白质沉淀析出。 但中性 盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质， 因此， 若除去中性盐或减低盐的浓度， 蛋白质就会重 新溶解。 有机溶剂沉淀蛋白质： 在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇， 蛋白质分子的水化膜被破坏而 沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。2) 不可逆沉淀作用 一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构， 尤其是空间结构破坏， 因而失去其原来的性 质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、加 热、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定：重金属盐类Cu 2+、Ag+、Pb2+

14、和Hg2+等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。生物碱试剂与 蛋白质结合形成不溶物， 使蛋白质沉淀。 植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为 生物碱(或植物碱)。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、 苦味酸、磷钨酸等。2试剂和器材1)试剂(1) 蛋白质氯化钠溶液 取 20ml 蛋清， 加蒸馏水 200ml 和饱和氯化钠溶液 l00ml ，充分搅 匀后纱布滤去不溶物。(加氯化钠的目的是溶解球蛋白)。(2) 蛋白质溶液 取 5ml 蛋清，用蒸馏水稀释至 100ml ，搅拌均匀后，用纱布过滤。(3) 饱和硫酸铵溶液 称固体(NH4) 2SO4加于100

15、0ml蒸馏水中，在70-80 C下搅拌促溶， 室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铁溶液。(4 )饱和苦味酸溶液 取2g苦味酸放入三角烧瓶， 加蒸馏水100ml , 80 C水浴约10min使 之完全溶解， 于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶， 上清液即为饱和苦味酸， 此液可存放数年。(5) 1 醋酸铅溶液(6) 1 硫酸铜溶液(7) 1 三氯乙酸溶液(8) 0.5 磺基水杨酸溶液(9) 1 醋酸溶液(10) 5 鞣酸溶液(11 )硫酸铵粉末2 )器材试管及试管架，抽滤瓶、量筒、布氏漏斗等3操作方法 1 )蛋白质的盐析作用 取 1 支试管加入 3ml 蛋白质溶液和 3ml 饱和硫酸

16、铵溶液， 混匀， 静置约 10min ，球蛋白则 沉淀析出， 过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末， 边加边用玻璃棒搅拌， 直至粉末不再溶解达到 饱和为止析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。2）乙醇沉淀蛋白质取 1 支试管加蛋白质溶液 lml ，加晶体氯化钠少许（加速沉淀并使沉淀完全）待溶解后再加 95% 乙醇 2ml 混匀，观察有无沉淀析出。3）有机酸沉淀蛋白质取 2 支试管，各加入蛋白质溶液约 0.5ml ，然后分别滴加 10% 三氯乙酸和 0.5 磺基水杨 酸数滴。观察蛋白质沉淀。4）重金属盐沉淀蛋白质取 2 支试管各加蛋白质溶液 2ml ，一管内滴加 1醋酸铅溶液，另一管内滴加

17、1% 硫酸铜溶 液，观察沉淀生成。5）生物碱试剂沉淀蛋白质取 2 支试管各加蛋白质溶液 2ml ，及 1% 醋酸 4-5 滴，其中一管滴加 5% 鞣酸，另一管滴加 饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法常用微量凯氏定氮法测定天然含氮有机物中的含氮量。 含氮有机物与浓硫酸共热， 被氧化成 二氧化碳和水， 而氮则转变成氨， 氨进一步与硫酸作用生成硫酸铁。 由大分子分解成小分子 的过程通常称为 “消化 ”。消化过程一般进行的比较缓慢。通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提 高消化液的沸点（消化液的沸点由290 C -400 C ），加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以

18、促进反应的进行。硫酸铵与浓碱作用可游离出氨， 借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中， 硼酸吸 收氨后使溶液中的 H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H +浓度为止。最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。（NH4 ） 2SO4 + 2NaOH宀2NH 4OH + Na 2SO4NH4OHNH 3 + H 2OH3BO4 t H + + H 2BO4NH3 + H + + H2BO4- T NH4H2BO4NH4H2BO4+ HCI t NH4CI + H JH2BO4-一、试剂和器材1试剂（1）消化液 30过氧化氢与硫酸与水的比例为 3:2:1 ，即在 1 份的蒸

19、馏水中缓慢加入 2 份 的硫酸，待冷却后，将其加到 3 份的过氧化氢中。临用时配制。催化剂硫酸铜（CuSO4£H2O ）与硫酸钾（K2SO4 ）以1 : 3配比研磨混合。（3） 40 氢氧化钠溶液 （4） 2 硼酸溶液（5）标准盐酸溶液（约 0.0100mol/L） （6 ）混合指示剂（田氏指示剂） 混合指示剂由 50ml 0.1 甲烯蓝乙醇溶液与 200ml 0.1 甲基红乙醇溶液混合配成。 贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。2. 器材 消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、 100ml 锥形瓶、 5ml 酸式滴定管。 一、操作方法

20、（一）微量凯氏定氮仪的构造和安装 凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个3-5 升容积的烧瓶。 蒸汽发生器借橡皮管与反应室相连。 反应室上边有二个小烧杯， 一个供 加样用，一个盛放碱液。 样品和碱液由此可直接到反应室中。 反应室中心有一长玻璃管，其 上端通到反应室外层， 下端靠近反应室的底部。 反应室下端底部有一开口， 上有橡皮管和管 夹。由此放出反应废液。反应所产生的氨可通过反应室上端细管经 冷凝管通入收集瓶中。 反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。 安装仪器时， 将蒸汽发生器垂直 地固定在铁架台上， 用橡皮管把蒸汽发生器、 反应室、冷凝管连接起来。橡皮管

21、连接的部位 应在同一水平位置。 冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。 安装完毕后， 不得轻 易移动，以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。（二）样品的处理1 固体样品 随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105 C的烘箱中干燥4h ，用增锅钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥 lh ，称重一次，恒重即可。2 血清样品 取人血（或猪血）放入离心管中，干冰箱中放置过夜。次日离心除去血凝块， 上层透明清液，即为血清。吸出 lml 血清加到 50ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀 备用。溶液如果显浑浊，加少量氯化钠

22、再混匀。（三）消化取 5 支消化管并编号，在 1 、2 、 3 号管中各加入精确称取的干燥样品（注意：加样品时 应直接送入管底， 避免沾到管口和管颈上） , 加催化剂 05g ，混合消化液 3ml ，在 4 、5 号 管中各加相同量的催化剂和混合消化液（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水） 作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。摇匀后，将 5 支消化管放在通风厨 内的远红外消煮炉上消化。先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质碳化变黑， 并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质丘升到消化管的颈部， 否则 将严重地影响样品测定结果。 当混合物停止冒泡， 蒸汽与二氧化碳也均匀

23、地放出时， 适当加 强火力。 在消化时， 应使全部样品都浸泡在消化液中， 如在瓶颈 t 发现有黑色颗粒， 应小心 地将消化管倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。通常消化需要 1-3h （对于那些赖氨酸含量 较高的样品需要更长的时间） 。待消化液变成褐色后， 为了加速消化完成， 可将消化管取出， 稍冷，加 30 过氧化氢溶液 1-2 滴于管底消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变 成清晰的淡蓝绿色，消化即告成功。为了保证消化彻底，再继续加热 0.5h 。消化完毕，取 出消化管冷却至室温。（四）蒸馏1仪器的洗涤 仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。目的在于洗去冷凝管中可能残留 的氨。对于处于使用状

24、态的仪器（正在测定中的仪器）加样前使蒸汽通过 1-2min 即可，对 于较长时间未使用的仪器， 必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸一指示剂混合液中指示剂的 颜色合格为止。洗涤方法如下：取 2-3 个 100ml 锥形瓶，加入 10m1 2 硼酸、 2 滴混合 指示剂，用表面皿覆盖备用。先煮沸蒸汽发生器，器中盛有 2/3 体积的用几滴硫酸酸化过 的蒸馏水，样品杯中也加入 2/ 3 体积蒸馏水进行水封。关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插 管进入反应室， 再由冷凝管下端逸出。 在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。 这样用蒸 汽洗涤 5min 左右，在冷 凝管下口放一个准备好的盛有硼酸 -指示剂的锥形瓶，

25、位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于 液体内，继续用蒸汽洗涤 1-2 min ，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色， 则证明蒸馏器内部已洗涤干净。 下移锥形瓶， 使硼酸液面离开冷凝管口约 1cm ，继续通蒸 汽 lmin 。最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。用右手轻提样品杯中棒状玻塞，使水 流入反应室的同时， 立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降 低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中， 再在样品杯中加入 2 / 3 体积 蒸馏水，如此反复三次即可排尽废液及洗涤液。打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出， 关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪 1-3m

26、in ，可进行下一次蒸馏。2样品及空白的蒸馏 取 5 个 100ml 锥形瓶， 分别加入 2硼酸 10ml ，混合指示剂 2 滴， 溶液呈紫红色， 用表面皿覆盖备用。 把消化管中的消化液全部转移到样品杯中， 用约 2ml 蒸 馏水冲洗消化管，重复 3 次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品 放入反应室， 用少量燕溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室， 盖上玻塞， 并在样品杯中加约 2/3 体积的蒸馏水进行水封。而后将装有硼酸一指示剂的锥形瓶放在冷 凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放 10ml40 氢氧化钠溶液于反应室后，立即上 提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。反

27、应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时起计时，蒸馏 3-5min ，移动锥形瓶，使硼酸液面离开 约 1cm ，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏 lmin ，将锥形瓶取出，用表面皿 覆盖以待滴定。 排废和洗涤等操作与前面相同。排废洗涤后， 可进行下一个样品的蒸馏 （每 一个样品要同时做三份， 以求得准确结果）。 待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴 定。（五）滴定 全部蒸馏完毕后，用 0.0100mol/I 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。（六）计算样品的总氮含量（g 氮/%） = （ A-B

28、）区0100 X14X100/ （C X1000） 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，（如血清）则：样品中的蛋白含量（g / % ） = （ A-B ）0.0100 X14X6.25 X100/ （C X1000）式中： A为滴定样品用去的盐酸体积 （ml ） ; B 为滴定空白用去的盐酸体积 （ml ） ; C 为称量样品的量 （g ） ; 0 . 0100 为盐酸的摩尔浓度 （ mol/l ） （实际上， 此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写） ; 14 为氮原子量； 6.25 为系数（ 1 ml0.01mol / I 盐酸相当于 0.14mg 氮）。若样品中除有 蛋白质外， 尚有其它含氮物

29、质， 则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。 首先，需向样品中加 入三氯乙酸，使其最终浓度为 5 % ，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样 品的上清液中的含氮量， 得出非蛋白氮量， 从而计算出蛋白氮， 再进一步折算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g/% ）=蛋白氮6.25IV 透析原理：透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质， 使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、 单糖等分开。 常用的半透膜是玻璃纸或称塞璐玢纸、 火棉纸或称塞璐锭纸盒其他改型的纤维 素材料， 透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里， 放入透析液 （蒸馏水或缓冲 液）中进行的，透析液可以更换，直

30、至透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值为止。 一、试剂和器材1试剂EDTA ，NaCO 3， NaOH 。2器材电炉，磁力搅拌器， 500ml 烧杯二、操作过程1透析袋的预处理： 取 100ml 0.01mol/l 的 EDTA 溶液， 加入 1gNaCO 3，溶解后用 NaOH 调 pH 值为 7.0 ；将透析袋剪成适宜长度， 放入 EDTA 溶液中煮沸 10 分钟， 然后用蒸馏水 冲洗，再用EDTA溶液煮10分钟，反复处理4-5次，在蒸馏水中与 4C保存备用。 2透析：将样品放入透析袋内，两端封闭（注意袋内不要留气泡） ，放入透析液中在磁力 搅拌器上透析。V 蛋白质含量测定一、双缩脲法测

31、定蛋白质浓度（一）目的 了解并掌握双缩脉法测定蛋白质浓度的原理和方法。（二）原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应， 在碱性溶液中蛋白质与硫酸铜形成紫色 络合物，在 540nm 处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的 颜色深浅成正比， 可用比色法定量测定。 双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测 定。（三）实验仪器 容量瓶、试管、吸管、分光光度计等。（四）实验试剂1. 标准蛋白溶液（5mg/ml ）准确称取已定氮的酪蛋白 （干酪素或牛血清白蛋白）用0.05mol/l氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。2. 双缩脲试剂：溶解 1.5g五水硫酸铜 和酒石酸钾钠于

32、500ml蒸馏水中，在搅拌下加入 300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到 1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内，此试剂可长 期保存。3. 样品血清：动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。（五）操作1 标准曲线的绘制：将7只干燥试管编号，按下表加人试剂：试剂ml）01q3456标淮蛋白溶液0 3a s1, 2L 82. 43. 0热懈水3. 02 72 4L 8L 20* 6蛋白威含常1屛nd）00.5L 02.03,04, 05.0AjESD各管混匀后，分别加入双缩脲试剂 3.0ml充分混匀，于37 C水浴30min ,在波长540nm处 比色，以0号管调零点测定各管吸光度，以吸光度为

33、纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标 准曲线。2样品测定 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml，置试管内，加入双缩脲试剂3.0ml充分混匀，在540nm 处测吸光度，对照标准曲线，求得未知溶液的蛋白质浓度（含量），在根据样品 稀释倍数换算为g/100ml。操作1、2应同时进行。此外还可用标准管法测定（可参见相关资料）二、福林-酚试剂法测定蛋白质浓度（一）目的熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。（二）原理蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。

34、（三）实验器材1. 蛋白质及其水解产物。2.722型（或7220型）分光光度计。3. 试管 1.5cmx1.5cm （ X8）o4. 吸管 0.50ml、0.10ml、0.20ml、5.0 ml。（四）实验试剂1. 福林-酚试剂 A :将 19 Na 2CO 3 溶于 50ml0.lmol/INaOH 溶液。另将 0.5gCuSO 4 5H 2O 溶于100mll %酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液。将前者 50ml与硫酸铜-酒石酸钾溶液Iml混 合。混合后的溶液一日内有效。2. Folin-酚试剂 B :将 100g 钨酸钠（Na2WO4 2H2O）、25g 钼酸钠（Na2MoO4 2H2O ）、

35、700ml蒸馏水、50ml 85 %磷酸及100ml浓盐酸置于1500ml磨口圆底烧瓶中，充分混匀 后，接上磨口冷凝管，回流10h。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15min，驱除过量的溴（在通风橱内进行）。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液呈微绿色，贮于棕色瓶中。临用前，用标准氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂（由于试剂微绿， 影响滴定终点的观察，可将试剂稀释100倍再滴定）。根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/l的酸（稀释1倍左右），贮于冰箱中可长期保存。3. 卵清蛋白溶液：约1g卵清蛋白溶于100 ml0.9%NaCI溶液，离心，取上清液，用克氏定 氮法测定

36、其蛋白质含量。根据测定结果，用 0.9 % NaCI溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白 质含量为2mg/l ，亦可用2mg/m1的牛血清白蛋白溶液。将卵清蛋白溶液准确稀释至500ug/l 。（五）、操作1. 标准曲线的绘制将7支干净试管编号，按下表顺序加人试剂。混匀，室温放置10min，各管再加Folin-酚试剂B 0.5ml , 30min后比色（500nm），做吸光度-蛋白质浓度曲线。Folin-酚法测定蛋白质浓度 一标准曲线的绘制试剂 看号01Jfirin'3456卵清蛋白00.050A0.20.40.5蒸锚求/mlQ.50.450.4030.20.10Fol in-K）试剂 A/e

37、L4.0404.04.0404.04.02. 样液测定准确吸取样液0.5ml置干净试管内，加入4mlFolin-酚试剂A , 10min 后，再加试剂B 0.5ml ,30min 后比色，对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。三、紫外光吸收法测定蛋白质浓度（一）目的 1了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。2熟悉紫外分光光度计的使用。（二）原理蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸， 在紫外光 280nln 波长处有最大吸收 峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比， 故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质 的含量。由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收， 对蛋白质测定有一定的干扰作用， 但

38、核酸的最大吸 收峰在 260 处。如同时测定 260nm 的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。 因此如溶液中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可通过计算测得溶 液中的蛋白质浓度。（三）实验器材1 . UV-9100 型紫外可见分光光度计2 容量瓶 50ml3 试管4 吸管 0.50ml 、 1.0ml 、 2.0ml 、 5.0ml（四）实验试剂 1卵清蛋白标准液：准确配制 1mg/1 卵清蛋白溶液。2未知浓度蛋白质溶液 ：用酪蛋白配制，浓度控制在 1.0 -2.5ml/l 范围内。3. 0.9%NaCI 。（五）操作1直接测定法在紫外分光光度计上，

39、将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中， 以生理盐水为对照， 测 得 280nm 和 260nm 两种波长的吸光度。将 280nm 及 260nm 波长处测得的吸光度按下 列公式计算蛋白质浓度。C = 1.45A280 0.74A260式中 C ：蛋白质质量浓度（ mg/ml） ；A280nm :蛋白质溶液在 280nm 处测得的吸光度；A260nm :蛋白质溶液在 260nm 处测得的吸光度。本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。为简便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm乘以0.75来代表其中蛋白质的大致含量（mg/ml ）

40、。2 .标准曲线法1 ）标准曲线的绘制取8支干净试管，编号，按下表加人试剂。紫外吸收法测定蛋白质浓度一标准曲线的绘制试剂 管号01734&卵沾蛋白畑00.050.10.2030.40.5蒸tfi水加10.50 450.4030.20.10Fol冷-妁试剂A/ml4.04.04.04.04.04.04.0加毕，混匀，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2 ）样液测定取未知浓度的蛋白液 1.0ml，加蒸馏水3.0ml，测A280,对照标准曲线求得蛋白质浓度。四、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度（一）目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。（二）原理考马斯亮

41、蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测 定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在 595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。（三）实验器材1旋涡混合器2 试管3 .吸管 0.10ml、0.50ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml4. 722型(或7220型)分光光度计5 .容量瓶1000ml6 .量筒 100ml7 .电子分析天

42、平(四) 实验试剂1.0.9% NaCI 溶液。2 .标准蛋白液：牛血清白蛋白(0.lmg / ml )，准确称取牛血清白蛋白0.2g ,用0.9%NaCI溶液溶解并稀释至 2000ml 。3 .染液：考马斯亮蓝 G250 ( 0.01% )，称取0.19考马斯亮蓝 G250溶于50ml 95 %乙醇中，再加人100ml浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1000ml。 4 .样品液：取牛血清白蛋白(0.lmg/ml )溶液，用 0.9%NaCI稀释至一定浓度。五、操作1 .标准曲线的制备取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。混匀，室温静置3min，以第I管为空白，于波长 595nm 处比色，读取吸

43、光度，以吸光度 为纵坐标，各标准液浓度(ug/ml )作为横坐标作图得标准曲线。试剂1 Cr V1734567标准蛋白液/nl-oT"o.y030.40.60.8Q 9SaCl ml1.0090.80,70.60.40.2考马斯亮日4.040404.04.04.04,0蛋白质浓度/ (ug/al)0LO20304060go ,A 5952 .样液的测定另取一支干净试管，加人样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液 4.0 ml，混匀，室温静置 3min ,于波长595nm 处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。样品蛋白质含量应在 10-100ug为宜。一些阳离子如K：

44、Na +> Mg2十、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质一、目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。二、原理凝胶层析也称凝胶过滤、 凝胶过滤层析、 分子排阻层析和分子筛层析。 凝胶是具有一定孔径 的网状结构物质， 凝胶层析是一种分子筛效应， 主要用于分离分子大小不同的生物大分子以 及测定其相对分子质量。 相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进人凝胶颗粒的内部， 而相 对分子质量大的物质不能进人凝胶内部， 被排阻在凝胶颗粒之外， 随着洗脱的进行， 相对分 子质量小的物质由于进人凝胶内部， 不断地从一个网孔穿到另一

45、个网孔， 这样 “绕道 ”而移动， 走的路程长，下来得慢（迁移速度慢）， 而相对分子质量大的物质因不能进人凝胶内部即随 洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，走的路程短，下来得快（迁移速度映），这样就可 达到分离的目的。目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶 （商品名 sephadex ）、聚丙烯酰胺凝胶 （商品名 Bio-GelP ）、 琼脂糖凝胶（商品名因生产厂家而不同，如瑞典的 Sepharose ，美国的 Bio-Ge1 A） ，其中 最常用的是 sephadex 。 sephadex 有各种不同型号，用于分离相对分子质量大小不同的物 质。三、实验器材1 .层析柱 1cmx 90cm2恒流泵3.紫外

46、检测仪4. 部分收集器5. 记录仪6. 试管等普通玻璃器皿四、实验试剂1 .待分离样品：胰岛素、牛血清白蛋白等2. 葡聚糖凝胶 Sephadex G-753. 蓝色葡聚糖 20004. 洗脱液： 0.1lmol/l pH6.8 磷酸缓冲液 五、操作1凝胶的处理Sephadex G-75 干粉经蒸馏水室温充分溶胀 24h ，或沸水浴中 3h ，这样可大大缩短溶胀 时间， 而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。 溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒 破碎。 凝胶颗粒大小要求均匀， 使流速稳定。 凝胶充分溶胀后用倾泌法将不易沉下的较细颗 粒除去。将溶胀后的凝胶抽干，用 10 倍体积的洗脱液处理约

47、lh ，搅拌后继续用倾泌法除去悬浮的 较细颗粒。2装柱 将层析柱垂直装好，关闭出口，加人洗脱液约 Icm 高。将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅 成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加人柱中，待底部凝胶沉积约 Icm 高时，再打开出口，继 续加人凝胶浆，至凝胶沉积至一定高度（约70cm ） 即可。装柱要求连续，均匀，无气泡，无“纹路”。3平衡将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱人口相连，用 2 一 3 倍床体积的洗脱液平 衡，流速为 0.5ml / min 。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸，以防加样时凝胶被冲起。 柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖 2 000 检查层析行为， 在层析柱内加 lml （ 2m

48、g / ml ）蓝色 葡聚糖 2 000 ，然后用洗脱液进行洗脱（流 0.5ml rnin ） ，若色带狭窄并均匀下降，说明 装柱良好，然后再用 2 倍床体积的洗脱液平衡。4加样与洗脱 将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将 1 司样品沿层析柱管壁小心 加入， 加完后打开底端出口， 使液面降至与凝胶面相平时关闭出口， 用少量洗脱液洗柱内壁 2 次，加洗脱液至液层 4cm 左右，按上恒流泵，调好流速（ 0.5ml / rn in ） ，开始洗脱。上 样的体积，分析用量一般为床体积的1一 2% ，制备用量一般为床体积的 20 一 30。5收集与测定用部分收集器收集洗脱液，每管 4m

49、l 。紫外检测仪 280nm 处检测，用记录仪或将检测信号 输人色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。6凝胶柱的处理 一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（ 2 一 3 倍床体积）即可，若凝胶有颜色或比较脏， 需用 0.5mol/l NaOH 一 0.5mol/l NaCI 洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放 2 个月无长霉情 况，但在夏季如不用，则要加 0.02 的叠氮钠防腐。VII SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量一、目的了解 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量。二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开， 是由于这些大分

50、子化合物所带电 荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程 度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 SDS 是十二烷基硫酸钠的 简称， 它是一种阴离子去污剂， 它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， 其 负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷， 也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差 别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一个因素， 就可根据标准蛋白质的相对分子质 量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 电泳（ SDS-PAGE ）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用

51、目前常用的垂直 平板电泳，样品的起点一致，便于比较。三、实验器材1直流稳压电泳仪。2垂直平板电泳槽。3移液器（ 1.0ml 、 200ul 、20ul ）。4微量注射器（ 20ul ）。 5烧杯、试管、滴管、直尺等四、实验试荆 1凝胶贮备液： 丙烯酰胺（ Acr ） 29.2g ，亚甲基双丙烯酞胺 （Bis ） 0.8g, 加重蒸水至 100ml 。 外包锡纸，4 C冰箱保存，30天以内使用。2分离胶缓冲液： 1.5mol/lTris-HCI , pH8.8 。18.15 Tris （三经甲基氨基甲烷），加约 80ml 重蒸水，用 lmol/lHCI 调 pH 到 8.8，用重蒸水稀释至最终体

52、积为100ml, 4 C冰箱保存。3浓缩胶缓冲液： 0.5mol/lTris-HCI , pH6.8。6gTris ，加约 60ml 重蒸水，用 lmol/lHCI 调 pH 至 6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml,4 C冰箱保存。4 1 0%SDS ，室温保存。5两类样品缓冲液：(l) 2 倍还原缓冲液0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml质量浓度 10%SDS 4.0ml质量浓度 0.1 溴酚蓝 0.5ml伊巯基乙醇 1.0ml总体积 10ml(2) 2 倍非还原缓冲液重蒸水 1.0ml0.5mol/LTris-HCI,pH6.8 2.5ml甘油 2.0ml质量浓度 10% SDS 4.0ml质量浓度 0.1 溴酚蓝 0.5ml总体积 10ml6电极缓冲液， pH8.3 。Tris 3g，甘氨酸14.4g,SDS 1.0g，加重蒸水至1000ml , 4 C 冰箱保存。7低相对分子质量标准蛋白质(上海产)，开封后溶于200ml 重蒸水，加 200ul2 倍样品缓冲液(还原缓冲液)，分装 20小管，-20 C保存。临用前沸水浴 3-5min。其相对分子 质量如下：标准蛋白质 Mr兔磷酸化酶 B 97400牛血清白蛋白 66 200兔