风湿性心脏病心肌肌球蛋白轻链的变化及其对心功能的影响

1、    风湿性心脏病心肌肌球蛋白轻链的变化及其对心功能的影响        【摘要】目的探讨风湿性心脏病(RHD)并心力衰竭患者心肌肌球蛋白轻链(VMLC)的变化及其对心功能的影响。方法采用蛋白印迹杂交技术(western blot hybridization analysis)对13例RHD心力衰竭患者心室肌中VMLC-1、2含量及组成比例进行定量分析；术前心功能指标采用肺动脉漂浮导管（Swan-Ganz 导管）进行检测；采用t检验及相关分析方法进行分析。结果VMLC-1、

2、2相对含量RHD组较正常对照组显著下降，尤以VMLC-2含量下降最为显著；VMLC-1、VMLC-2组成比例发生了明显的改变；VMLC-1、2相对含量的变化与心排血量（CO）、心脏指数（CI）、左心作功（LCW）、左心作功指数（LCWI）、每搏量（SV）、每搏指数（SI）等心功能指标密切相关。结论VMLC-1、2含量的下降和组成比例的改变导致了心肌收缩功能的损害，参与了RHD心力衰竭的发生发展，是影响RHD心力衰竭患者术后心功能恢复的重要因素之一。【关键词】风湿性心脏病；心肌；肌球蛋白轻链；心室功能 Alterations of cardiac ventricular myosin light

3、 chains in human ventricular myocardium and the effect on cardiac function in patients of rheumatic heart diseaseLANG Xilong, ZHU Jialin, ZHANG Baoren（Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, PLA, Shanghai200433, China）【Abstract】ObjectiveTo study t

4、he change of ventricular myosin light chains (VMLCs) and effect on cardiac function in rheumatic heart disease (RHD). MethodsUsing Western blot hybridization assay, we detected VMLC-1, VMLC-2 in 13 patients with RHD and 7 cases of health people. Cardiac function parameters were measured by Swan-Ganz

5、 catheter before operation. The results were analyzed by t test and linear correlation analysis. ResultsAs compared with the normal group, the contents of VMLC-1 and VMLC-2 were decreased significantly (P<0.001) in RHD patients, especially the VMLC-2, the ratio of VMLC-1/VMLC-2 in RHD patients va

6、ried from 10.95 to 10.61. Linear correlation analysis showed that the alterations in relative contents of VMLC-1 and VMLC-2 were correlated with the cardiac function such as cardiac output, cardiac index, left cardiac work, left cardiac work index, stroke volume and stroke index. ConclusionThe resul

7、ts show that the values of VMLC-1, VMLC-2 and the ratio of VMLC-1/VMLC-2 are all changed during the development of heart failure in RHD patients, so it might lead to the damage of the myosin structure and affect the cardiac systolic and diastolic functions. These changes may induce a direct effect o

8、n the progressive deterioration of heart function.【Key words】Rheumatic heart disease;Myocardium;Myosin light chains;Ventricular function风湿性心脏病(RHD)是引起慢性心力衰竭（心衰）的常见病因。临床工作中发现：RHD心衰患者在解除瓣膜功能障碍后，部分患者的心功能并无明显改善，有些甚至趋于恶化，证明RHD心衰是多环节和多因素造成的。心肌收缩蛋白是心肌收缩与舒张功能的最终承担者，心室型肌球蛋白轻链(VMLC)是心肌收缩蛋白的一种，由1、2两种亚型组成，有收缩功能

9、和氧化磷酸化功能1，2。其在RHD心衰发生发展中的变化规律及其对心功能的影响尚少见报道。本研究拟对RHD心衰患者心室肌中VMLC-1、2含量及组成比例进行分析，结合术前血流动力学监测，探讨RHD心衰过程中VMLC的变化规律及其对心功能的影响。资料与方法1. 病例与分组：随机选择RHD行二尖瓣、主动脉瓣双瓣膜置换者13例为RHD组，其中男性7例，女性6例，年龄3254(45.3±7.9)岁，心功能(NYHA)级3例，级10例。对照组7例，男性，年龄2245(38.4±7.8)岁，为脑死亡除外心血管病变者。2. 抗体：鼠抗人VMLC-1单克隆抗体(多伦多大学临床生化研究室史沁卫

10、博士惠赠)；兔抗人VMLC-2多克隆抗体(California大学K.R. Chien教授惠赠)。3. 术前心功能检测：手术麻醉诱导前，颈内静脉穿刺置入肺动脉漂浮导管（Swan-Ganz导管）进行血流动力学检测，检测指标包括：心排血量（CO）、心脏指数（CI）、左心作功（LCW）、左心作功指数（LCWI）；心功能计算方法：66S多功能监护仪全自动计算，CO根据热稀释法原理测定3。4. 标本采集：心肌组织均取自左室乳头肌根部，RHD组于术中体外循环建立，心脏停跳后30 min内取材，正常对照组于脑死亡后24 h内取材。5. 心肌组织MLC的提取：采用Shi等4报道的方法稍加改进完成：去除透析步骤

11、,提取过程在4进行, 提取全过程中加入PMSF并保持浓度在1 mmol/L。6. 蛋白电泳：采用5%积层胶，15%分离胶的SDS-PAGE系统。7.蛋白印迹杂交：采用电转移法将凝胶内的蛋白转移至硝酸纤维素膜，丽春红S染色，膜上蛋白条带清晰，证明转膜成功。将干燥好的硝酸纤维素膜放入杂交管，加入含1%牛血清白蛋白的封闭液，37转动2 h，弃封闭液，加入杂交液及VMLC-McAbs，37转动杂交1 h，弃杂交液，加入生物素标记的羊抗鼠IgG，37转动孵育1 h，以NBT+BCIP显色后风干，摄片。8.密度扫描定量：每张硝酸纤维素膜对照组的第一样品均来自同一标本，密度扫描时将第一样品条带1 mm

12、15;1 mm面积密度值定为1.0，从而计算出第一样品条带密度值，其余各条带密度值以第一标本密度值为标准，由凝胶像分析仪自动测得。9.统计学处理：实验数据均以±s表示，两组之间的统计采用t检验方法，相关分析采用直线回归方法，检验及分析过程在NCSS统计软件上完成，P值以计算值表示，P<0.05为统计学差异有显著性。结果1. VMLC-1, VMLC-2 Western blot杂交结果见1，2。注：1、2为对照组，38为RHD组1VMLC-1 Western blot杂交显影注：15为对照组，610为RHD组2VMLC-2 Western blot杂交显影2.心肌组织中VMLC

13、各亚型含量的变化: (1) VMLC-1，VMLC-2的变化： VMLC-1相对含量RHD组较对照组显著减少18.43%(0.992±0.2491.216±0.154, P<0.05)；VMLC-2相对含量RHD组较对照组显著减少32.74%(0.798±0.2551.191±0.132, P<0.001)；VMLC-2较VMLC-1显著减少19.50%(P<0.001)，对照组VMLC-1、2含量差异无显著性(P>0.05)。(2) VMLC-1/VMLC-2比值：RHD组10.9510.61，正常组11.0210.96。3.

14、VMLC-1，VMLC-2相对含量与心功能的关系：将VMLC-1，VMLC-2相对含量与血流动力学参数作直线相关分析显示：VMLC-1含量与CO、CI、LCW、LCWI呈显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.745、0.568、0.729、0.675； VMLC-2含量亦与上述血流动力学参数呈显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.828、0.623、0.868、0.793。讨论正常心脏组织中肌球蛋白（myosin）是由两条重链(MHC)及四条轻链(MLC)组成的六聚体，肌球蛋白轻链(MLC)是肌球蛋白分子的主体和骨架，有收缩功能和氧化磷酸化功能1。因此，MLC-1、

15、MLC-2两亚型含量下降将导致心肌收缩功能的损害。在成人心房及心室肌中，其相应的两种亚型MLC的总量组成为115，6。Hailstones等7研究发现，正常人各种肌肉组织中，MLC-1，MLC-2是成对出现的、由两条MHC，两条MLC-1，MLC-2组成的肌球蛋白，其收缩效能最高，因此MLC-1，MLC-2两亚型组成比例上的异常必将导致心肌收缩力的下降。我们应用Western 杂交方法，观察RHD心衰患者心室肌中VMLC-1、2相对含量及其组成比例的变化。结果显示：VMLC-1、2相对含量较正常对照组均有明显下降，其中尤以VMLC-2含量下降最为明显，心肌中VMLC-1/VMLC-2比值发生了

16、明显的变化（10.9510.61）。Schaper等8在扩张型心肌病终末期心衰患者的研究中亦证明VMLC-2含量明显下降甚至消失; VMLC-1/VMLC-2比值降至10.110.69，并认为VMLC-2的下降是由MLC激酶分解所致，它可特异性分解VMLC-2而重链不受影响9；Hofmann等10，11通过实验验证， VMLC-2的缺失可使肌球蛋白和肌动蛋白的解离速度下调，从而影响心室的舒缩功能。由于VMLC-2本身可氧化磷酸化，参与心肌舒缩时的能量供应，其含量的下降，势必影响到心肌舒缩时的能量供应，同时上述两种轻链含量的下降，使得心肌肌原纤维的结构遭到破坏，势必影响到心肌的收缩功能，我们通过

17、心功能检测证实了上述结论，即VMLC-1，VMLC-2的相对含量与CO、CI、LCW、LCWI等心功能指标有良好的相关性。因此，我们认为RHD心衰患者心室肌中VMLC两亚型含量的下降和比值的改变参与了RHD心衰的发生发展，是影响RHD心衰患者术后心功能恢复的重要因素之一。（本文编辑：宁田海）基金项目：国家自然科学基金资助项目（39670716）作者单位：郎希龙（200433 上海，第二军医大学附属长海医院胸心外科）朱家麟（200433 上海，第二军医大学附属长海医院胸心外科）张宝仁（200433 上海，第二军医大学附属长海医院胸心外科）郝家骅（200433 上海，第二军医大学附属长海医院胸心外

18、科）吴弘（长海医院心内科）朱泉芳（200433 上海，第二军医大学附属长海医院胸心外科）参考文献1，Fugimoto K, Yasue H, Nakao K, et al. Novel monoclonal antibodies specific for human cardiac myosin light chain-1: useful tools for analysis of normal and pathological hearts. J Histochem Cytochem, 1993, 41: 35-422，Holt JC, Caulfield JB, Norton P, et

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