黑木耳多糖对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转化及bFGF和PDGF表达变化的研究

1、··868文章编号1672-3619（2009）08-0868-03·实验研究论著·黑木耳多糖对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞表型转化及bFGF和PDGF表达变化的研究郭素芬1，成永霞1，孙平2（1牡丹江医学院病理学教研室，牡丹江157011；2牡丹江医学院人体解剖学教研室，牡丹江157011）通过黑木耳多糖对血管平滑肌细胞表型转化及bFGF和PDGF表达变化的影响，探讨黑木耳多糖降血脂和抗氧化以外的抗动脉粥样硬化形成作用。方法将30只新西兰白兔随机分为正常对照组、模型组和实验组3组，分别给予普通饲料（正常组）、高胆固醇饲料（模型组）以及高胆固醇加黑木耳多糖

2、饲料（实验组）喂养。第12周末处死动物，取主动脉行组织形态学观察及用透射电镜和免疫组织化学方法分析平滑肌细胞表型转化及bFGF和PDGF表达变化。结果实验组主动脉斑块面积明显小于模型组，模型组和实验组分别和（，两组比较差异有统计学意义（；透射电镜和免疫组化结果显示：模型组动为（044±010）030±083）P001）脉粥样硬化斑块的平滑肌细胞内内质网、线粒体增多，主要为合成表型；而实验组平滑肌细胞内内质网、线粒体结论黑木耳多糖可抑制动脉粥样硬化过程中血少，主要为收缩表型，并且斑块内bFGF和PDGF的表达减少。管平滑细胞从收缩表型向合成表型的转化，从而抑制平滑肌细胞合成和

3、分泌bFGF、PDGF和其他细胞外基质的能力，从而减少动脉粥样硬化形成中血管平滑肌细胞参与的过程。【关键词】黑木耳多糖；血管平滑肌细胞；表型转化；动脉粥样硬化中图分类号：R5435文献标识码：A【摘要】目的EffectsofAuriculariaAuriculaPolysaccharideonthePhenotypesofVascularSmoothMuscleCellsandtheExpressionofbFGFandPDGFinAtherogenesisGUOSu-fen1，CHENGYong-xia1，SUNPing2（1DepartmentofPathology，MudanjingMe

4、dicalCollege，Mudanjiang157011；2DepartmentofHumanAnatomy，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China）ObjectiveToexploretheeffectofauriculariaauriculapolysaccharideonthephenotypesofvascularsmoothmusclecells（VSMCs）andthealsoexpressionofbasicfibroblastgrowthfactor（bFGF）andplatelet-derivedgrowthfacto

5、r（PDGF）intheformationofatherosclerosis（AS）MethodThirtyNewZealandwhiterabbitswererandomlydividedintothreegroups：normalgroup，modelgroupandexperimentalgroupTheperiodofexperimentistwelveweeksNormalgroupreceivednormalfoodchowModelgroupreceivednormalchowandcholesterol，andtheexperimentalgroupreceivednormal

6、chow，cholesterolandpolysaccharideAnimalsweresacrificedafter12weeksoftreatmentExcisedarterysegmentswerepreparedforhisto-morphologicalobservationTransmissionelectronmicroscopyandimmunohistochemicalmethodswereusedtodeterminethephenotypesofVSMCandtheexpressionofbFGFandPDGFResultComparedwiththemodelgroup

7、，atheroscleroticlesionswerealleviatedintheexperimentalgroup（modelgroup：044±010，experimentalgroup：030±083，P001）ElectronmicroscopyandimmunohistochemicalstudiesshowedthatmitochondriaandendoplasmicreticulumofVSMCswererichedinatheroscleroticplaquesinthemodelgroup，butnotintheexperimentalgroupVSM

8、Csweremainlysynthesizedtypeinmodelgroup，butweremainlycontractedtypeinexperimentgroupbFGFandPDGFexpressionwerealsodecreasedintheatheroscleroticlesionConclusionAuriculariaauriculapolysaccharidecouldinhibitthephenotypicconversionofVSMCfromcontractedtypetosynthesizedtypeinatherogenesisItcouldalsoinhibit

9、thesecretionofbFGF，PDGFandotherextracellularmatrixs，thusdecreasedtheformationofatherosclerosis【Keywords】auriculariaauriculapolysaccharide；vascularsmoothmusclecell；phenotypicconversion；atherosclerosis血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）基金项目：黑龙江省卫生厅重点资助项目（。No2007-012）作者简介：郭素芬，副教授，硕士，研究方向为动脉粥样硬化的发【A

10、bstract】的增殖、迁移和表型转化是动脉粥样硬化（atherosclerosis，斑块形成中的重要因素。根据结构和功能不同，As）VSMC分为收缩型和合成型两种表型。收缩型VSMC呈分化状病机制与防治。态，不能增殖；合成型VSMC是去分化细胞，具很强的增殖能力。二者的差别是收缩型SMC胞质内含丰富的肌丝及密体，而合成型SMC胞浆则参与生物-肌动蛋白含量多；合成的内质网、线粒体等含量较多，缺乏收缩能力，但其移增殖以及分泌能力强，能合成和分泌多种细胞因子，产行、1生大量细胞外基质，促进As斑块的形成和发展。多糖是··869埋、聚合、修块，作06m的半薄切片，次甲基兰-天青、

11、碱性复红染色，光镜下观察组织学变化并定位、筛选组织块；然后用超薄切片机切片（厚500魡），并进行双重电子染色，透射电子显微镜观察斑块内平滑肌细胞的细胞器变化。16统计学分析数据以均数±表示，用SPSS100软件处±s）理，组间比较用方差分析，以P005判定差异的显著性。由10个以上的单糖连接起来的大分子物质，我们以往的研究发现：黑木耳和甘薯内有丰富的活性多糖，可以通过2，3降血脂、抗氧化和抑制而减少As的形成。本实验旨在21结果主动脉病理变化研究黑木耳多糖对As血管平滑肌细胞表型转化及bFGF和PDGF-B表达的影响，以探讨多糖降血脂、抗氧化以外的抗As形成作用。211大体

12、观察正常组兔主动脉内膜光滑，无脂质斑块形成。模型组兔主动脉内膜可见明显的脂质斑块形成，重者整条主动脉内膜可见弥漫分布脂质斑块形成，其主动脉。实验脂质斑块与主动脉内膜表面积之比达（044±010）组兔主动脉内膜虽可见脂质斑块形成，其主动脉脂质斑块与主动脉内膜表面积之比为（，较模型组明显030±083）下降（。P005）212主动脉免疫组织化学染色免疫组化染色阳性结果为斑块内有棕黄色颗粒。正常组内膜及中膜有少量散在棕黄色颗粒，内膜完整（图1A，图2A）。模型组在AS斑块中呈明显的棕黄色颗粒，与对照组比较差异有统计学意义（；实验组表达明显弱于模型组（，但仍强P001）P001）表

13、1、图1B，。于对照组（P001，1C和图2B，2C）表1111材料与方法材料和试剂新西兰白兔由牡丹江医学院实验动物中心提供；黑木耳多糖：白色粉末，由黑木耳提取，其多糖的提取过程和3，其中多糖含量约为用量参照甘薯糖蛋白的提取和用量蛋白质含量约为964；胆固醇购于广州市器化医8312，疗设备有限公司。bFGF和PDGF-B单克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。12动物分组及处理新西兰白兔30只，兔龄6个月，体重2025kg。随机分为正常组、模型组、实验组3组，每组10只，实验期为模型组喂饲普通饲料高胆12周。正常组喂饲普通饲料；固醇05g只d；实验组喂饲普通饲料高胆固

14、醇05g只d多糖01gkg·动物分笼饲养，d。饲料均制成颗粒，自由饮水。13标本制备3组中PDGF-B、bFGF蛋白的表达groupsTab1TheexpressionofPDGF-BandbFGFinthethree组别正常组模型组实验组视野数PDGF-B平均光密度值3030300017±00060385±0043*0214±0021*bFGF平均光密度值0010±00030306±0012*0197±0028*第12周末以空气栓塞法处死动物，解剖后立即于主动脉弓处取1×1mm3标本，用3戊二醛预固定，用于电镜检

15、测；然后将主动脉至髂动脉分叉处离断取出，生理盐水冲洗后，纵向剖开，中性福尔马林固定，所有标本于主动脉弓处取材进行常规酒精脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为5m，用于HE染色和bFGF和PDGF-B免疫组化染色。14形态学观察与正常组比较，与模型组比较，P001*P001；22电镜观察正常组平滑肌细胞为梭形，平行排列，细胞内内质网和高尔基复合体少（图3A）。模型组斑块内平滑细胞形状不规则，细胞内质网扩张，线粒体增生肿胀、嵴减少甚至空泡化，主要为合成表型平滑肌细胞（图3B）。实验组斑块内平滑细胞内质网扩张，线粒体增生肿胀减轻，细胞核周围。密体增多（图3C）图1图3见封三。将上述取材后主动脉经苏丹

16、染色，数As斑块面积：码相机照相，采用HPIAS-1000病理图像分析系统，计算着色处（桔红色）面积占整条主动脉面积的百分比。免疫组化染色：斑块内免疫组化染色采用SABC法，一bFGF和PDGF抗体工作浓度分别为1200和1100，抗孵肓时间为4过夜。阴性对照片以PBS替代bFGF和显色试剂为DAB，显微镜下控制显PDGF-B单克隆抗体，色程度。常规脱水、透明、中性树胶封片。结果判定采用病理图像分析系统于每张切片随机选3个视野，计算内膜及斑块区PDGF-B和bFGF阳性染色的平均光密度值。15电镜观察3讨论黑木耳多糖是从黑木耳中提取的有效成分，具有良好3的降血脂、抗氧化和减少As形成等功用。黑

17、木耳中多糖的含量丰富，易提取。本研究用黑木耳多糖饲喂高脂饮食家兔后发现实验组As斑块面积明显小于模型组。以往的研究证明As斑块面积的减少与黑木耳多糖的降血脂和减少血管平滑肌细胞增殖密切相关。本实验从VSMC超微结将3戊二醛固定的标本，常规进行后固定、脱水、包··870构及斑块内PDGF和bFGF表达方面研究黑木耳多糖对模型组血管平滑肌细VSMC表型转化的影响。结果显示，胞内的内质网和线粒体很丰富，即多为合成表型；而实验组血管平滑肌细胞内的内质网和线粒体则较少，而密体较由此可知，黑木耳多糖可以抑制斑块多，即多为收缩表型。内VSMC表型转化，这也与我们以往的实验黑木耳多糖能抑制

18、血管平滑肌细胞的增殖结果相一致，因为VSMC表型4由收缩型向合成型转化是其增殖的先决条件，即黑木耳此，从平滑肌的超微结构和功能方面看，黑木耳多糖能抑制血管平滑肌细胞由收缩表型向合成表型的转化并能抑制其合成和分泌能力，从而减少血管平滑肌细胞参与的动抗氧化以脉粥样硬化形成，即黑木耳多糖发挥了降血脂、外的抗As形成作用。参考文献蔡生业血管平滑肌细胞表型转化及相关信号转导1张健，机制探讨：J心血管病学进展，2005，26（2）8185包海花，李志强甘薯的抗家兔主动脉粥样硬化2郭素芬，：形成作用J中国动脉硬化杂志，2004，12（1）2326李志强，李静，等黑木耳多糖对动脉粥样硬化3郭素芬，形成中平滑肌

19、细胞增殖的影响J中国动脉硬化杂志，：2006，14（9）767770焦磊，徐红涛，等去甲肾上腺素促进血管平滑肌增4刘斌，：殖和细胞表型转化J解剖学杂志，2008，31（4）493495温进坤，韩梅血管再狭窄发生过程中SM-actin和5李琦，SMemb基因表达的变化及其影响机制研究J中国生物化学与分子生物学报，2000，：16（6）832836温进坤，韩梅反义c-jun表达质粒对血管平滑肌细6李琦，胞表型转化标志的影响J中国动脉硬化杂志，2001，9（：1）69（收稿日期：修回日期：20090312；20090507）多糖可以通过抑制VSMC表型转化而抑制其增殖，从而减通过免疫组化研究又少动脉

20、粥样硬化的发生发展。此外，发现，bFGF和PDGF的表达在实验组较模型组明显减少。即具有促（P001）PDGF是一种较强的促有丝分裂因子，增殖和迁移的生物活性又能引起平滑肌细胞的合成及分泌功能增强。bFGF可促进VSMC的去分化和DNA合成，从而刺激VSMC表型转化和增殖，其机制可能与诱导原5，6癌基因表达有关。收缩型VSMC的增殖及合成和分泌而bFGF和PDGF合成和分泌减bFGF和PDGF的能力弱，少反过来可抑制血管平滑肌细胞进入细胞周期而增殖，保从本实验免疫组化结果可持血管平滑肌细胞的收缩表型。以得出，黑木耳多糖可以减少斑块内PDGF和bFGF的表达，其可能原因一方面是黑木耳多糖通过抑制

21、VSMC的表型转化而抑制了其自分泌和旁分泌连锁放大反应；另一方面黑木耳多糖也可能通过降血脂和抗氧化作用而减少了单核巨噬细胞、血管内皮细胞的bFGF和PDGF的分泌。因!（上接第930页）参考文献：2009，364（1515）3994076LeviDM，PolatUNeuralplasticityinadultswithamblyopia：JProcNatlAcadSciUSA，1996，93（13）683068347LeviDMPerceptuallearninginadultswithamblyopia：aDevreevaluationofcriticalperiodsinhumanvisionJ：46（3）222232Psychobiol，2005，8EIMallahMK，ChakravarthyU，HartPMAmblyopia：is：visuallosspermanentJBrJOphthalmol，2000，84（9）952956方谦逊视觉发育与弱视9阴正勤，J国外医学眼科学：分册，1992，16（4）2