高效液相色谱法测定瑞巴匹特的血药浓度及其药代动力学研究

1、    高效液相色谱法测定瑞巴匹特的血药浓度及其药代动力学研究        摘要目的：建立血浆中瑞巴匹特浓度的高效液相色谱分析方法，并用此方法研究瑞巴匹特在人体内的药代动力学。方法：血样经酸化，用乙酸乙酯单步萃取后，以甲醇-pH3的磷酸盐缓冲液(5248)为流动相，在紫外230nm处检测。所得数据用3p87药代动力学程序处理，求出相应的参数。结果：瑞巴匹特血浓度在201200g.L-1范围内与色谱峰高呈良好线性关系，血浆中药物最低检测浓度为10g.L-1，日内及日间RSD(

2、n=5)分别在1.11%3.72%和3.87%7.60%，方法回收率为99.84%100.20%。药代动力学研究表明，口服国产和进口瑞巴匹特片剂的血药浓度-时间曲线均符合一级吸收一级消除的一房室模型，体内药物达峰时间分别为(1.95±0.73)h和(1.57±0.55)h；cmax分别为(510.8±152.0)g.L-1和(564.8±187.7)g.L-1；t1/2分别为(1.75±0.63)h和(1.66±0.3)h；国产瑞巴匹特片的相对生物利用度为(99.36±7.87)%。结论：此方法简便、可靠，测定灵敏度高，能较

3、好地满足瑞巴匹特临床血药浓度监测及人体内药代动力学的研究。关键词瑞巴匹特；高效液相色谱法；药代动力学HPLC assay for determination of rebamipide in plasma and its pharmacokinetic investigationZhao Rongsheng (Zhao RS),Duan Jingli (Duan JL),Yan Baoxia (Yan BX) (Department of Pharmacy,The Third Hospital of Beijing Medical University,Beijing100083)ABSTRA

4、CTOBJECTIVE:To establish a HPLC method for the determination of rebamipide in human plasma and investigate the pharmacokinetic characteristics of rebamipide in healthy volunteers after a singal oral dose.METHODS:The drug was extracted from plasma with ethyl acetate after acid purification，and then d

5、etected by UV detector at 230nm with a mobile phase consisting of methanol：phosphate buffer (5248).The data obtained were fitted with 3P87 program on computer.RESULT:A linear relationship was obtained between the peak height and the concentration of rebamipide from 20g.L-1 to 1200g.L-1 and the limit

6、 of detection was 10g.L-1.The average relative deviations (RSD) of within day and between day variation were 1.113.72% and 3.877.60% (n=5) respectively.The recoveries of rebamipide were 99.48100.20%.The results showed that the plasma concentration-time curve of the two preparations were all fitted t

7、o a one-compartment model with first order absorption and elimination.Tpeak of domestic and imported tablets were 1.95±0.73 and 1.57±0.55h;cmax were 510.8±152.0 and 564.8±187.7g.L-1;t1/2 were 1.75±0.63 and 1.66±0.31h;respectively.CONCLUSION:This experiment established a

8、 simple,highly sensitive and selective method for the determination of plasma rebamipide levels in humans.It provides a suitable analysis method for its pharmacokinetic studies.KEYWORDSrebamipide,HPLC,pharmacokinetics瑞巴匹特(rebamipide)是日本大?公司90年代初开发的一种新型胃炎、胃溃疡防治药。它能促进胃粘膜中前列腺素的合成，通过加强胃粘膜的防御功能来防治胃溃疡12。目

9、前，国内外对该药的研究都不多，关于瑞巴匹特血药浓度检测的方法国内尚未见报道，国外仅有两篇文献23报道，均为高效液相色谱荧光检测法，但该法样品制备处理复杂。本实验建立了瑞巴匹特反相高效液相色谱紫外检测方法，并用该法对10名健康志愿者口服国产和进口瑞巴匹特后的药代动力学进行了研究，取得了满意的结果。1材料和方法1.1药品和试剂国产瑞巴匹特片(浙江海宁强力宁制药有限公司，100mg/片，批号：960814)；进口瑞巴匹特片(商品名：Mucosta,日本大?药厂，100mg/片，批号：6 J84 MT5)；瑞巴匹特标准品(浙江海宁强力宁制药有限公司提供，上海医工院研制合成)；甲醇、磷酸(分析纯，北京化

10、工厂)；磷酸二氢钾(分析纯，北京红星化工厂)，乙酸乙酯(分析纯，北京化工三厂)，乙酸乙酯临用前重蒸；水为重蒸馏去离子水。1.2仪器及色谱条件SP8810高效液相色谱泵，Spectra UV2000紫外检测器，SP4290积分仪(美国TSP)；YKH-型液体快速混合器(江西医疗器械厂)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)。色谱柱：Spheri-5 RP-18，220mm×4.6mm(美国TSP公司)；流动相：甲醇-0.05mol.L-1 pH3的磷酸盐缓冲液(5248)，过滤并脱气；流速：1.0ml.min-1；紫外检测波长：230nm；积分仪衰减为16；纸速0.25mm.m

11、in-1。1.3血样的采集健康男性志愿者10人，经检查心、肝、肾功能均为正常，试验前两周未服用过任何药物。受试者交叉po单剂量600mg国产和进口瑞巴匹特片，分别于服药前及服药后0.25，0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12及24h各采取静脉血4ml，置肝素抗凝管中，分离血浆后置于-20冰箱保存待测。间隔一周后交叉给药，重复试验。1.4样品处理方法精密吸取人血浆样品1.0ml置于10ml刻度离心管中，加入1mol.L-1磷酸溶液0.5ml，乙酸乙酯2.0ml，涡旋振荡2min，3000r.min-1离心5min，精密吸取上层有机相1.0ml，置1.5ml离心管中，60水浴下氮气吹干，用

12、100l甲醇溶解后涡旋振荡1min，12 000r.min-1离心5min，取20l进样，进行液相色谱分析。1.5血浆标准曲线制作于健康人空白血浆中加入不同量的瑞巴匹特标准液，使其浓度分别为20，50，100，200，400，800，1200g.L-1，样品处理方法同上，经HPLC测定，以峰高H为纵坐标，药物浓度c(g.L-1)为横坐标进行回归，得血浆标准曲线。1.6方法精密度和回收率方法精密度：在空白血浆中精密加入不同量的瑞巴匹特标准品，使血浆浓度分别为50，200，600g.L-1，按前法分别于日内和日间提取，测定日内变异和日间变异。方法回收率：在空白血浆中精密加入不同量的瑞巴匹特标准品，

13、使血浆浓度分别为50，200，600g.L-1，按前法处理，测定血浆中瑞巴匹特的相对回收率。绝对回收率：在空白血浆中精密加入一定量的瑞巴匹特标准品，配制成浓度分别为50，200，600g.L-1的血浆样品，再以流动相代替血浆配制成同样浓度的样品作为对照组样品，按前法进行处理，测定色谱峰高，将血样与对照组相应峰高比较得绝对回收率。1.7药代动力学研究血药浓度测定结果用3P87程序处理，并计算药代动力学参数及国产制剂的相对生物利用度。2结果2.1色谱行为空白血样及服用瑞巴匹特后血样的色谱，见1。由谱可见，在本试验所选分析条件下，瑞巴匹特与血浆中内源性组分得到良好分离，瑞巴匹特的保留时间为8.15m

14、in。1空白血浆及含药血浆色谱A-空白血浆；B-含药血浆2.2线性关系与检测限本法血浆中瑞巴匹特浓度在201200g.L-1范围内，峰高H与浓度c呈线性相关，回归后得标准曲线方程为：H=284.0+22.7c,(r=0.9999)。该方法的最低检测浓度为10g.L-1。2.3精密度在本试验条件下，将高、中、低不同浓度的瑞巴匹特血浆样品分别于日间和日内提取进样，测定日内相对标准差、日间相对标准差，其RSD分别在1.11%3.72%，3.87%7.60%范围内，结果见表1。表1HPLC测定血浆中瑞巴匹特的精密度.n=5浓度/g.L-1日内日间实测值RSD/%实测值RSD/%5045.02±

15、;1.683.7250.19±3.817.60200197.06±5.112.59195.32±7.563.87600623.28±6.911.11592.30±25.674.332.4方法回收率在本实验条件下，人血浆中不同浓度药物的平均回收率在98.31%100.20%范围内，结果见表2。 表2回收率试验结果.n=5浓度/g.L-1实测值/g.L-1回收率/%RSD/%5049.74±2.6399.48±5.265.29200196.62±5.5698.31±2.782.83600601.20±

16、;6.40100.20±3.203.192.5绝对回收率在本实验条件下，测得的人血浆中不同浓度药物的绝对回收率结果见表3。 表3瑞巴匹特在血浆中的绝对回收率.n=5浓度/g.L-1绝对回收率/%平均回收率/%RSD/%92.905089.1292.183.094.5196.0720097.2095.212.792.3596.0960095.2994.622.092.472.6药代动力学研究10名健康志愿者交叉po两种制剂后的药时曲线经计算机拟合一室模型与二室模型间无显著差异(P0.05)，以一级吸收一级消除的一房室模型为优，见2。po两种制剂后的主要药代动力学参数见表4，国产瑞巴匹特

17、片的相对生物利用度为(99.36±7.87)%，其RSD为7.92%。210名健康志愿者po单剂量600mg瑞巴匹特后平均血药浓度-时间曲线-国产；-进口表4健康志愿者po单剂量瑞巴匹特片600mg后的药代动力学参数参数国产片进口片t1/2Ke/h1.75±0.631.66±0.31t1/2Ka/h0.83±0.360.68±0.38Lag time/h0.23±0.230.17±0.13V/F/L×1030.69±0.340.62±0.11Cl/F(s)/L.h×10-30.27&#

18、177;0.050.27±0.07tmax/h1.95±0.731.57±0.55cmax/g.L-1510.8±152.0564.8±187.7AUC/g.h.L-12506.9±413.92549.7±513.13讨论3.1瑞巴匹特的理化性质比较特别，它难溶于甲醇和乙醇，几乎不溶于水和乙醚，po瑞巴匹特后，体内血药浓度很低，cmax仅为数百ng，这都使得血浆中药物的萃取浓集非常不易。国外文献报道的血浆样品制备方法步骤繁琐，而且测定时有较多杂质干扰；本实验试用了多种萃取方法及各种不同的提取取有机溶剂，结果发现，在弱酸性条件

19、下用乙酸乙酯提取，可达较高提取效率，且测定时血浆杂质干扰少。精密度及回收率试验表明，本法准确、可靠，且重现性好；国外文献采用荧光检测器测定血药浓度，最低检测限为10ng.ml-1，本试验用紫外检测器测定，最低检测限亦可达10ng.ml-1，可见本法的灵敏度较高。3.2由于瑞巴匹特与血浆中某些内源性成分的性质相似，影响了测定时的分离效果。本试验通过改变流动相的配比和pH来选择最佳分离条件，结果表明，最佳分离的流动相组成为甲醇-缓冲液(5248)，最佳分离pH为3，在选定的试验条件下，瑞巴匹特与血浆中组分能达到基线分离。试验中发现，用甲醇溶解样品后，在进样前再以12000r.min-1离心，可使测定时血浆杂质峰减少。3.3将每位志愿者的药时数据用3P87药代动力学程序处理后，拟合出药代动力学模型，并求得相应的体内参数，结果表明，国产瑞巴匹特与进口瑞巴匹特生物等效，二者在健康人体内吸收分布等性质相似。试验结果表明，本法能较好地满足瑞巴匹特临床血药浓度监测及体内药代动力学研究。 作者单位：