凝胶层析分离混合蛋白实验报告

1、竭诚为您提供优质文档 /双击可除第 1 页共 14 页凝胶层析分离混合蛋白实验报告篇一：凝胶过滤法分离蛋白质实验报告凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化 蛋白质。二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及 固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝 胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水 可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路 短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应 的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出， 通透性居

2、中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按 大到小的顺序流出实现分离的目的。三、试剂与仪器O.1mol/L 磷酸缓冲液(ph7.0 ), 0.4%K3Fe(cn)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm 的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1. 凝胶溶胀2. 装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm 的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约 17cm,并使其床面覆盖缓冲 液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲 液洗脱 23 次。3. 样品处理4. 上样和过滤：吸取约 0.5ml 混合液，在距离床面 1mm处沿管

3、内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入 凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用12 倍体积的此缓冲洗脱。5. 部分收集：控制速度为 0.5ml/min 左右，用试管收集 洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色篇二：生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定凝 胶层析法实验一蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。第 2 页共 14 页2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实 验技能。二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大 小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过 凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技 术。

4、该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状 颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致， 像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于 颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用 此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液 的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移 动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质 可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的 分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗 入凝胶的物

5、质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同 相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的 程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼 此可以分离开来。将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以 Vt 表示。 实质上 Vt 是由 Vo，Vi 与 Vg 三部分组成，Vo 称为“孔隙体第 3 页共 14 页积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之 间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg 为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与 Vo 与 Vi 之间的关系可用下式表 示：Ve=Vo+KdVi式中 Ve 为洗脱体积，自

6、加入样品时算起，到组分最大 浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd 为样品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd 是分子量不同的溶质在凝胶内部与 外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗 粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可以改写为：Kd=（Ve-Vo）/Vi上式中 Ve 为实际测得的洗脱体积；Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红 蛋白，印度黑墨水，分子量约 200 万的蓝色葡聚糖-2000 等） 通过实际测量求得；Vi 可由 gxwr 求得（g 为干胶重量，单 位为

7、克；wr 为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此， 对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗 脱体积就可算出它的 Kd 值。如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，贝 U 不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物第 4 页共 14 页质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝 胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo 时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo+Vi 时，出现洗脱峰。Ve 与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有

8、关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分 子量大的走在前面。Ve 与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logm,式中 m 为相对分子质量，K1 和 K2 为常数，Ve 也可用 Ve-Vo。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如 sephardexg-75 的分级范围是 3000-80000 的球形分子。在本实验中用于分离蓝色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。三、仪器和试剂1. 仪器：层析柱核酸蛋白检测器（或紫外分光光度计）、自动部分收集器、刻度管。2. 试剂：蓝色葡聚糖 2000、sephardexg-75、洗脱液：0.2mol/LTris-hcL-K

9、cL,ph7.5 。3. 待测样品：蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、cytc。四、实验步骤1.凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。第 5 页共 14 页取葡聚糖 sephardexg-75 干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶 胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀 3 小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌 和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅 拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的 细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。2. 装柱与平衡装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内

10、加入约1/3 柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约 2 3cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm 处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、 无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过 23 倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表 面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起， 并始终保持凝胶上端有一段液体。 3.调整洗脱速度上样前应调整洗脱速度，用自动收集器收集流出液，记录每收集 2ml 液体所需时间，调整其速度在2min 左右。按上述时间设置

11、自动更换收集管。3 .上样与洗脱样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不第 6 页共 14 页均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面12mm 寸，关闭出口，用滴管将 1ml 样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当 样品滲入床中接近床表面 1mml时关闭出口。按加样操作，用少量(约 1ml )洗脱液冲洗管壁 2 次。最后加入少量洗脱液 于凝胶上，使高出床表面35cm,旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的 1 2%制备用量为柱床容积的20%30% 4.收集与鉴定每个收集管内液体用紫外检测仪在280nm 波长处检测，出现最高的一个 oD 值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。 5.凝胶柱的处理凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用 0.5