mIg免疫荧光实验

1、）组员：组员： 赵涛（赵涛（13201510211320151021） 王枭（王枭（13201510221320151022） 黄敏（黄敏（13201510231320151023） 母利（母利（13201510241320151024） 王权皓（王权皓（13201510251320151025）临床临床K-10班第四小组班第四小组 2015年年4月月21日日1、掌握免疫荧光标记技、掌握免疫荧光标记技术直接法的原理和操作方术直接法的原理和操作方法；法；2、熟悉荧光显微镜的使、熟悉荧光显微镜的使用方法。用方法。B淋巴细胞表面携带的淋巴细胞表面携带的mIg，为，为B细胞特异性的表细胞特异性的表面标

2、记，能与相应的特异性抗体结合，故可用荧面标记，能与相应的特异性抗体结合，故可用荧光标记的抗光标记的抗Ig血清进行免疫荧光染色镜检。由于血清进行免疫荧光染色镜检。由于B细胞在分化过程中的每个阶段均具有细胞在分化过程中的每个阶段均具有mIg的标的标记记 ，故该法课检出全部，故该法课检出全部B淋巴细胞。每一淋巴细胞。每一B细胞细胞的的mIg（IgE、IgA、IgM、IgD、IgG）不同，分）不同，分别可以用荧光标记的抗别可以用荧光标记的抗Ig单克隆抗体染色，则可单克隆抗体染色，则可鉴别带不同类鉴别带不同类Ig的的B淋巴细胞。能与荧光标记抗淋巴细胞。能与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下细胞膜可呈

3、现荧体结合的细胞，在荧光显微镜下细胞膜可呈现荧光，即为光，即为mIg阳性细胞，也就是阳性细胞，也就是B淋巴细胞。同淋巴细胞。同时用普通光源照明，计数该视野内的淋巴总数，时用普通光源照明，计数该视野内的淋巴总数，根据发荧光和不发荧光的计数，就可以算出根据发荧光和不发荧光的计数，就可以算出B细细胞的百分比。胞的百分比。材料 1、FITC（异硫氰酸荧光素）（异硫氰酸荧光素）标记的羊抗人标记的羊抗人IgM 2、受检者静脉抗凝血、受检者静脉抗凝血 3、RPMI 1640完全培养液完全培养液 4、5%胎牛血清胎牛血清 Hanks液液 5、淋巴细胞分离液（比重、淋巴细胞分离液（比重1.0770.001） 6

4、、0.2%台盼蓝染液台盼蓝染液 7、清洁载玻片、盖玻片、血球计数板、清洁载玻片、盖玻片、血球计数板、 计数器、毛细吸管、试管、显微镜计数器、毛细吸管、试管、显微镜 操作流程 1 1、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离 2 2、用、用RPMI 1640RPMI 1640完全培养液重悬分离完全培养液重悬分离得到的单个核细胞，混合后计数，并得到的单个核细胞，混合后计数，并用用0.2%0.2%台盼蓝染液测细胞活力。用台盼蓝染液测细胞活力。用RPMI 1640RPMI 1640完全培养液将细胞悬液配成完全培养液将细胞悬液配成5 5106106mL mL 。 3 3、在试管中加入配制好的淋巴细胞悬、在试管中加入配

5、制好的淋巴细胞悬液液0.10.1mL ，再加入荧光抗体，再加入荧光抗体0.1mL ，放置放置4作用作用30min4 4、加已经、加已经37 37 预温的含预温的含5%5%胎牛胎牛血清血清 Hanks Hanks液液23mL23mL，1500rpm1500rpm离心离心10min,10min,去上清液，去上清液， 重复洗涤重复洗涤2 2次。次。5.5.取沉淀细胞滴加在载玻片上，取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察。察。实验结果观察 一般先用荧光显微镜紫外光计数，继用普通光学光源一般先用荧光显微镜紫外光计数，继用普通光学光源计数同一视野中淋巴细胞总数

6、。每份标本计数计数同一视野中淋巴细胞总数。每份标本计数200个个淋巴细胞，着荧光者为淋巴细胞，着荧光者为B淋巴细胞，计算其百分比，淋巴细胞，计算其百分比，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的淋巴细胞的绝对值。绝对值。 免疫荧光染色细胞的形态和类型：凡呈现微弱，均匀免疫荧光染色细胞的形态和类型：凡呈现微弱，均匀一致的暗淡荧光者为非一致的暗淡荧光者为非B细胞；凡细胞呈现较强荧光，细胞；凡细胞呈现较强荧光，有明显的细胞轮廓，并可见环状或两个以上斑点或在有明显的细胞轮廓，并可见环状或两个以上斑点或在细胞的一侧见有帽状结构的为细胞的一侧见有帽状结构的为B细胞细胞 正常人外周血中正常人外周血中mIg阳性细胞均值阳性细胞均值SD为为11.2%1.5% 1、每次实验前荧光抗体需、每次实验前荧光抗体需3000rpm离心离心30min,以除去荧光以除去荧光血清中的聚合蛋白血清中的聚合蛋白 2、