大鼠小肠缺血再灌注后血中NO和SOD浓度与肺损伤的相关性研究

1、大鼠小肠缺血再灌注后血中NO和SOD浓度与肺损伤的相关性研究         10-09-04 09:12:00     编辑：studa20                   作者：李纪鹏董光龙王为忠项红军 【摘要】  目的：探讨大鼠小肠缺血再灌注后血中一氧化氮（NO），超氧

2、化物歧化酶（superoxide diamutase, SOD）的浓度变化与肺组织中Bax、Bcl-2、p53的表达及肺组织超微结构变化的相关性。方法：建立小肠缺血再灌注模型，分为对照组，再灌注后0、30 min，1、2 h，1、3、7 d共8组，于各时相点检测血中NO和SOD的浓度，用免疫组织化学SP法观察肺组织中Bax、Bcl-2、p53的表达情况，透射电子显微镜观察肺组织细胞超微结构变化。结果：大鼠小肠缺血再灌注后0 min NO浓度升高，但至再灌注2 h时则明显降低，其后又持续升高，至再灌注7 d时达高峰。SOD浓度在再灌注0 min明显下降，再灌注2 h时升高，随后持续下降，至再灌注

3、7 d时达最低水平。Bax、Bcl-2免疫阳性细胞主要位于肺组织中血管内皮细胞和肺泡上皮细胞。再灌注0 min，Bax、Bcl-2阳性细胞表达率升高，30 min时其阳性细胞表达率均分别升高为17.1%和78.1%，Bcl-2表达高于Bax（P0.01）。2 h时降低，其后升高，7 d时阳性细胞表达率达到高峰，分别为94.1%和83.4%，Bax表达明显高于Bcl-2（P0.01）。透射电子显微镜显示肺组织细胞超微结构损伤改变。结论：血中NO、SOD浓度变化和肺组织中超微结构的改变说明小肠缺血再灌注后可引起肺组织细胞凋亡和损伤，而大鼠小肠缺血再灌注后Bax、Bcl-2、 p53在肺组织细胞中的

4、阳性表达均有明显改变并可能引起细胞凋亡和损伤。 【关键词】  缺血再灌注损伤·小肠·肺损伤·一氧化氮·超氧化物歧化酶    【ABSTRACT】 Objective: To study the changes of concentration of NO, SOD in serum and the expression of Bax, Bcl-2, P53 and the changes of ultrastructure in the lung. Methods: Models of ischemia reper

5、fusion of small intestine were established at 0, 30min, 1, 2h, 1, 3, 7d after reperfusion. The concentration of NO, SOD in the serum was examined at the same time .The expressions of Bax, Bcl-2 and P53 in the lung were observed by immunohistochemical SP method and the changes of ultrastructure in th

6、e lung were observed by transmission electron microscopy. Results: The concentration of NO increased apparently 0 minute after reperfusion, but decreased after two hours, then increased gradually to a peak at seven days. The concentration of SOD decreased 0 minute after reperfusion, increased after

7、two hours, and decreased to the lowest level at seven days. The Bax ,Bcl-2, P53 positive cells were observed in lung tissue The ratio of positive cells of Bax, Bcl-2 and P53 began to increase after 0 min and increased continuously after reperfusion 30min, with the rate of positive cells of Bcl-2 hig

8、her than that of Bax（P<0.01）.But they decreased apparently at 2h, then increased and reached the peak 7d after reperfusion, with the rate of Bax higher than that of Bcl-2（P<0.01）.Transmission electron microscopy showed injuries in the lung. Conclusion: The changes of concentration of NO, SOD a

9、nd the ultrastructural changes suggest the apoptosis and injuries in the lung.    【KEY WORDS】 Reperfusion injury·Intestine，small·Lung injury·Nitric oxide·Superoxide dismutase    缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）是临床上常见的一种损伤现象，缺血再灌注（ischemia re

10、perfusion, IR）所产生的反应性氧中间产物激活炎症免疫细胞，产生全身炎性反应，随后早期即可引起远处器官如肺、肝、肾等损伤，有研究表明严重的肢体缺血再灌注（limb ischemia reperfusion, LIR） 可致急性肺损伤（acute lung injury, ALI）1。这种ALI的病理组织学变化主要为肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损，但其确切机制和损伤方式仍不十分清楚2。本研究通过建立大鼠小肠IR模型，研究血清中超氧化物歧化酶（superoxide diamutase, SOD）的表达及肺中Bax、Bcl-2、p53的表达及电子显微镜下组织超微结构的变化情况，探讨小

11、肠IRI后对于肺的损伤及其机制，为研究不同因素引起的IR对远处器官的次级损害的机制和防治建立基础。    1材料与方法    1.1实验材料采用由第四军医大学实验动物中心提供的雄性Wistar大鼠64只，体质量200300 g。随机分成正常对照组，IR后0、30 min，1、2 h和1、3、7 d共8组。    1.2主要试剂Bcl-2、Bax和p53鼠单克隆抗体（MBI公司），SP免疫组织化学染色超敏试剂盒（福州迈新生物技术公司），DAB显色试剂盒（Sigma公司），速眠新（购自长春农牧大学兽医研究所）

12、。    1.3制备模型以速眠新（0.5 mL/kg）肌肉注射麻醉后，仰卧位固定于操作板上，按无菌手术操作开腹、提出小肠，于肠系膜根部分离肠系膜上动脉，用10号丝线结扎阻断30 min后松开恢复血流。于开放后0（动脉开放即刻）、30 min，1、2 h，1、3、7 d分别切取肺组织块置入40 g/L戊二醛固定；并取其组织以4%多聚甲醛磷酸缓冲液（0.01 mol/L PBS, pH=7.4）固定。    1.4NO和SOD的测定NO测定：设空白管（不加标本和亚硝酸钠）、标准管（加入20 mol/L亚硝酸钠）和测定管（加入0.3 mL待

13、测血清）。各管混匀放置10 min，3 5004 000 r/min离心10 min，取上清液0.8 mL。加入显色剂0.4 mL混匀，15 min后测其吸光度值。在提前制备的标准曲线（亚硝酸钠系列溶液）查找相应NO浓度。SOD测定：按测试盒要求设测定管和对照管，测试管中加入各种反应液和待测血清混匀。37 恒温水浴40 min，加显色剂混匀，10 min后倒入1 cm光径比色杯中，蒸馏水调零，用酶标仪于波长550 nm比色。按公式SOD活力（NU/mL，亚硝酸盐单位/毫升）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度×2×稀释液倍数，计算SOD活力。对照管中不加血清样本，

14、其他同测定管。     1.5免疫组织化学方法Bax、Bcl-2和p53测定：组织块脱水、石蜡包埋3 m厚切片。切片经脱蜡水化后，PBS漂洗10 min，依次以氧化酶阻断剂和非免疫血清室温孵育10 min，PBS漂洗15 min后，切片分别滴加Bcl-2、Bax和p53单克隆抗体室温孵育60 min，PBS漂洗，再依次滴加生物素标记第二抗体和链霉菌抗生物素蛋白（三抗）室温孵育10 min，最后以DAB反应510 min，自来水终止反应及PBS漂洗。以苏木精复染后，切片经乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片光镜下观察。用PBS分别代替第一、二、三抗体做阴性对照。

15、结果判定：细胞质内出现棕黄色颗粒或匀质样棕黄色结构为Bcl-2、Bax免疫反应阳性细胞；p53免疫阳性细胞细胞核呈深染棕黄色颗粒，部分细胞质也有少许染色。各例切片连续观察5个高倍视野，计数每100个细胞中的阳性细胞数为阳性细胞率。    1.6电子显微镜观察规定时间内取肺组织切成1 mm×1 mm×1 mm组织块，置40 g/L戊二醛固定4 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）漂洗；10 g/L四氧化锇固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗，常规丙酮脱水。Epon 812包埋，70 、8 h聚合。LKBNOVA型超薄切片机切片

16、，醋酸铀和柠檬酸铅电子染色，JEM-2000EX电子显微镜观察并拍摄照片，加速电压10 kV。    1.7统计学处理采用SPSS11.0统计软件包进行分析，所得数据以x±s表示，进行组间方差分析（F检验）。P0.05为差异有统计学意义。    2结果    2.1NO和SOD的浓度改变大鼠小肠IR后NO浓度在再灌注0 min明显升高，但至再灌注2 h时明显降低，其后又持续升高，至再灌注7 d时达高峰；SOD浓度在再灌注0 min明显下降，再灌注2 h时升高，随后持续下降，至再灌注7 d时达最低

17、水平（表1）。    2.2肺组织中Bax、Bcl-2和p53的表达再灌注0 min，Bax、Bcl-2和p53阳性细胞表达率开始升高，再灌注30 min，Bax、Bcl-2和p53阳性细胞表达率均明显升高，分别为17.1%和78.1%和7.12%（表2），Bcl-2阳性细胞率明显高于Bax阳性细胞率，两者差异有统计学意义（P0.01）。但至2 h时明显降低，其后持续升高，7 d时阳性细胞率达到最高水平，分别为94.1%和83.4%和39.7%（见表2），Bax阳性细胞更为密集，其阳性细胞率明显高于Bcl-2阳性细胞率，两者差异有统计学意义（P0.01，图1）。    2.3肺组织超微结构的改变肺泡间隔略有增宽，毛细血管可见大量中性粒细胞并附壁，基膜完整，肺泡型细胞排空明显，并脱落至肺