shRNA文库RNA干扰研究者的福音

1、shRNA文库：RNA干扰研究者的福音letters to natureNature 428,427 - 431 (25 March 2004); doi:10.1038/nature02370<>A resource for large-scaleRNA-interference-based screens in mammalsPATRICK J. PADDISON 1,*, JOSE M. SILVA 1,*, DOUGLAS S. CONKLIN 1,*,?, MIKE SCHLABACH 2,?, MAMIE LI 2, SHOLA ARULEBA 1, VIVEKANAN

2、D BALIJA 1 ANDY O'SHAUGHNESSY 1, LIDIA GNOJ 1, KIM SCOBIE 1, KENNETH CHANG 1, THOMAS WESTBROOK 2,?, MICHELE CLEARY 3, RAVI SACHIDANANDAM1,W. RICHARD MCCOMBIE 1, STEPHEN J. ELLEDGE 2,? & GREGORY J. HANNON1 Cold Spring Harbor Laboratory, Watson School of Biological Sciences, 1 Bungtown Road, C

3、old SpringHarbor, New York 11724, USA2 Department of Biochemistry, Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine, One Baylor Plaza, Houston, Texas 77030, USARosetta Inpharmatics, 12040 115th Avenue NE, Kirkland, Washington 98034, USAThese authors contributed equally to this work ? Pres

4、ent addresses: Department of Biomedical Sciences, Center for Functional Genomics, University at Albany, East Campus, B342A, One University Place, Rensselaer, New York 12144-2345, USA (D.S.C.);Department of Genetics, Harvard Partners Center for Genetics and Genomics, Harvard Medical School Room 158D,

5、 NRB, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, Massachusetts 02115, USA (M.S., T.W. and S.J.E.)Correspondence and requests for materials should be addressed to G.J.H. () or S.J.E. ().Gene silencing by RNA interference (RNAi) in mammalian cells using small interf

6、ering RNAs (siRNAs) and short hairpin RNAs (shRNAs) has become a valuable genetic tool. Here, we report the construction and application of a shRNA expression library targeting 9,610 human and 5,563 mouse genes. This library is presently composed of about 28,000 sequence-verified shRNA expression ca

7、ssettes contained within multi-functional vectors, which permit shRNA cassettes to be packaged in retroviruses, tracked in mixed cell populations by means of DNA 'bar codes', and shuttled to customized vectors by bacterial mating. In orderto validate the library, we used a genetic screen des

8、igned to report defects in human proteasome function. Our results suggest that our large-scale RNAi library can be used in specific, genetic applications in mammals, and will become a valuable resource for gene analysis and discovery.2004年3月30日，Open Biosystems 公司正式宣布对外发售。该 Expression Arrest? shRNA L

9、ibraries 构建者们设计、合成、测序并克隆了上千个小分子发夹RNA ,研究者只需在网上数据库中选择特定的shRNA克隆就可在近期内得到用于RNAi用的shRNA世界著名分子生物学实验室美国冷泉港实验室(CSHL )的Dr. Hannon设计、测序并克隆获 得了大量的shRNA克隆，shRNA可以在常规的 DNA 载体上表达。Expression Arrest? shRNA克隆可以通过转染方法进入细胞，或者也可以通过病毒介导(腺病毒或逆转录病毒)进入细胞。体外稳定转染可以构建持续的细胞系，持久抑制目标基因表达。全球的研究或商业性的实验室目前正在大范围的使用 RNAi技术评价基因的功能，而

10、Expression Arrest? shRNA文库的产生促进了人和小鼠的基因功能研 究，具有非常重要的科研和应用价值。Expression Arrest? shRNA 文库由 Open Biosystems 公司运作上市， 目前人和小鼠的文库 总共包括6,500个基因，每个基因包括1-4个shRNA克隆。这些基因主要是一些非常有应用前景的基因，其蛋白质成分有可能在将来的疾病治疗领域发挥作用。该文库正在发展壮大，OpenBiosystems 寄希望将来的文库能包括目前所有证实的人和小鼠基因，且每个基因包括6-10个shRNA克隆。Expression Arrest? shRNA文库的出现是大规

11、模RNAi筛选技术的突破，科研工作者可以通过非常简单的方式直接从该文库中找到针对某特定基因的shRNA ,无需耗时耗力的 siRNA设计、合成和验证过程。Benefits of shRNA vs. siRNAsiRNAshRNA使用代价高相对较低持久性最多2周可选择获得稳定整合的细胞宿主类型细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细胞系设计复杂的设计方法Completed获取需要合成Completed应用瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒侵染检测方法Western杂交、表型分析RT-PCR、芯片检测Western杂交、表型分析、 RT-PCR、芯片检测研究领域细胞培养细胞培养&体外研究Express

12、ion Arrest Human shRNA Library美国冷泉港实验室 （CSHL）的Dr. Hannon构建的人的shRNA文库由大量针对验证的目标 基因设计的shRNA克隆组成。human shRNA 1.1 版本的文库包括 8,500 shRNA 克隆，涉及5,700 人类基因。该文库可以快速、高效地对哺乳动物细胞进行功能缺失的遗传筛选和遗传相互作用的 检测。冷泉港实验室（CSHL ）提供的人的shRNA文库的出现可以免去客户设计和合成siRNA的烦恼，针对目标基因的每个小分子shRNA均被克隆和测序验证。为了确保最有效的调控基因的表达水平，每个基因都设计了多个shRNA克隆，每个

13、shRNA序列都分别与目标基因的特异序列相对应。当您订购对某一个基因下单时，该基因所有的 shRNA克隆都会一起提供给您。pSM1 Vector载体元件意义U6启动子产生的RNA的3'端有4个突出的U逆转录病毒信号序列与包装蛋白的成分形 成复合物感染哺乳动 物细胞PKG-Puro哺乳动物细胞中转染稳定性的选择氯霉素细菌筛选标记同源重组位点通过同源重组将 shRNA 表达框转入载体Expression Arrest Mouse shRNA Library美国冷泉港实验室(CSHL )的Dr. Greg Hannon构建了针对小鼠特异目标基因的shRNA文库。1.1版本的文库包括 3,50

14、0 shRNA克隆，覆盖850小鼠基因。该文库可以快速、高效地 对哺乳动物细胞进行功能缺失的遗传筛选和遗传相互作用的检测。冷泉港实验室(CSHL )提供的小鼠的 shRNA文库的出现可以免去客户设计和合成siRNA的烦恼，针对目标基因的每个小分子shRNA均被克隆和测序验证。为了确保最有效的调控基因的表达水平，每个基因都设计了多个shRNA克隆，每个shRNA序列都分别与目标基因的特异序列相对应。当您订购对某一个基因下单时，该基因所有的shRNA克隆都会一起发给您。pSM1 Vector载体元件意义U6启动子产生的RNA的3端有4个突出的U逆转录病毒信与包装蛋白的成分形号序列成复合物感染哺乳动

15、 物细胞PKG-Puro哺乳动物细胞中转染 稳定性的选择氯霉素细菌筛选标记同源重组位点通过同源重组将 shRNA表达框转入载 体(斑马鱼)文库Zebrafish Morpholino LibraryExpression Arrest Zebrafish Morpholino 文库由美 国著名的 Gene Tools, LLC 公司开发，Open Biosystems是该公司的独家代理。通过该模式生物可以 为科研工作者提供了解译基因功能的途径。吗咻寡聚核甘酸 (Morpholino oligonucleotides , MF )吗咻寡聚核甘酸(MF)是非离子型 DNA类似物， 其中的核糖被吗咻所

16、代替，磷酸二酯键被 phosphoroamidate所代替，可从 Gene Tools LLC 公司(Corvallis , OR, USA)购得。最近，已经有综述介绍了它在应用上的成功和局限性，尤其聚焦于发育生物学上的应用，因为大多数发表的关于吗咻复合物的文章是用斑马鱼月5胎进行研究的。Genesis杂志的整个一期（volume30 , issue3 , 2001 ）都是关于利用这项技术进行的基因功能研究。用MF对斑马鱼胚胎中广泛表达的GFP基因（转基因产物）在所有的细胞中进行了敲除。在这项研究中建立了等量的已知基因突变和人类疾病模型，利用MF确定了一些新的基因功能。有报道说MF可以纠正突变

17、的 b球蛋白前体 mRNA的错误剪接，具有潜在的治疗意义。用与错 误剪接位点互补的寡聚核甘酸处理地中海贫血病人外周血中的红细胞祖先，可以纠正错误剪接， 提高血色素A的合成。Catalog Number: PZF1245 - Individual Zebrafish MorpholinoZebrafish Morpholino文库包括上千个寡核甘酸序列，每个寡核甘酸序列都是针对目标序列的转录起始位点而设计的，可以快速诱导基因表达水平的下调。Morpholinos寡核甘酸特异性非常高并且具有核酸酶抗性，因此其可以长效地、特异性诱导目标基因的表达下调。Morpholino 一般与目标基因起始位点的序

18、列互补 每个寡核甘酸都通过质谱检测验证，无菌包装运输干粉）。（大概互补区间长度在25-50个碱基左右），购买时，每个morpholino 的量是50 nM （冻? 特异性与目标基因的起始位点互补? 高核酸酶抗性? 可单独购买，也可以 96-well板形式购买? 到货周期短果蝇RNAi文库Catalog Number:RDM1189 - Drosophila RNAi CollectionRDM1190 - Individual RNAi ConstructsRNAi出现为研究果蝇的基因功能提供了新的途径。Openbiosystem 公司提供的果蝇 RNAi文库包括7,000 DNA序列，可以直接用来体外转译产生RNAo该文库中的dsDNA可以覆盖果蝇基因组的50 %以上。对于每个基因，均采用特异性引物扩增其外显子序列（约 300-600个碱基）。DmRNAi结构包括两个 T7启动子， 无RNase ,可直接用于体外转译研究。Open Bios