HPLC测定血浆和尿液中头孢匹胺的浓度

1、    HPLC测定血浆和尿液中头孢匹胺的浓度        摘要：目的建立头孢匹胺在人体血浆和尿液中的快速HPLC测定方法。 方法血浆和尿液样品经去蛋白、解离处理后，用RP-HPLC进行分析。 采用Discover ODS C18柱250 mm×4.6 mm，5 m，流动相为甲醇-三乙胺醋酸液 -水64031357，pH 5.38，紫外检测波长为254 nm，乙酰苯胺为内标。结 果血浆和尿液中头孢匹胺回收率为(99.58±2.94)%和(98.72

2、77;1.97)%，在1.251 60 g.ml-1和2.5160 g.ml-1范围内线性良好(r=0.999)，日内、 日间RSD均小于5%，重现性良好，RSD小于7%。结论本法简便 、准确、灵敏、经济，适于体内药物分析。关键词：高效液相色谱法；头孢匹胺；血浆；尿液中分类号：TQ460.7+2文献标识码：A文章编号：1001-2494(2000)11-07 65-03Determination of cefpiramide in human serum and urine by HPLCCHEN Zhi-gang,ZHEN Jian-cun,ZHANG Tong-he（Department

3、of Pharmacy,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China）ABSTRACT：OBJECTIVETo establish an RP-HPLC method for the determination of cefpiramide(CPM) level in plasma and urine.METHODS After precipitating protein and extracting,the concentrations of CPM wer e analysed by RP-HPLC.The separation was p

4、erformed in a Discovery ODS-C18 column (250 mm×4.6 mm,5 m) with a mobile phase of methanol:acetic-trieth ylamine-H2O=64031357(pH 5.38).The UV detector at 254 nm was selected. The internal standard was acetanilide.RESULTThe recoveries of CPM in plasma and urine were (99.58±2.94)% and (98.72

5、±1.97)%,respectively.T he calibration curves were linear over the range of 1.25160 gml-1 in seurm and 2.5160 gml-1 in urine with a correlation coefficient of 0 .999.The RSD was less than 7%.CONCLUSIONThe method is s imple,precise,accurate and usable for studies in human.KEYWORDS：HPLC;cefpiramid

6、e;plasma;urin头孢匹胺(cefpiramilde)属第三代头孢菌素，具有抗菌谱广、消除半衰期长、组织中分布广 、体内药物浓度高等特点，近年被引入国内，应用于临床。国外采用自动柱切换技术和毛细 管电色谱12测定其在体液中的含量，但方法成本高，作者在国内尚未见有关方 法学报道。本实验采用RP-HPLC测定头孢匹胺在血浆和尿液中的药物浓度，样品预处理 3简单、易行，方法灵敏度高、重现性好，经济、快速，能够满足体内药物分析的需要。1材料与方法1.1仪器与试药岛津10A高效液相色谱仪(LC-10Atvp单元泵，SPD-10Avp紫外检测器，Class-vp 5.22色谱工 作站，20 l定量

7、环)。头孢匹胺对照品(中国药品生物制品检定所)，头孢匹胺注射液(日本住友制药株式会社)。甲 醇(色谱纯)，水(超纯蒸馏水)，其余试剂均为分析纯。三乙胺醋酸液：三乙胺14 ml，冰醋酸5.7 ml，加蒸馏水稀释至100 ml。1.2实验方法1.2.1色谱条件色谱柱：Discover ODS 250 mm×4.6 mm,5 m。流动相：甲醇-三乙胺醋酸液-水64031357，用1 molL-1的醋酸调pH 至5.38，流速：0.8 mlmin-1，柱温2730，检测波长：254 nm。1.2.2对照液和内标液的配制对照液：精密称定头孢匹胺对 照品160 mg，置100 ml量瓶中，加流动

8、相至刻度。内标液：精密称定乙酰苯胺250 mg，用流 动相定溶于10 ml量瓶中，精密量取1 ml，再用流动相定溶于100 ml量瓶中，储存备用。1.2.3血浆样品预处理精密量取血浆样品0.3 ml，加入20 l内标液，涡旋混合30 s，加入10%的三氯乙酸0.9 ml，涡旋震荡90 s，高速离心(10000 r min-1)10 min，取上清液0.5 ml，加入乙醚1.0 ml，振荡萃取1 min，取水相50 l 进样，样品于-20保存。1.2.4尿液样品预处理取尿液1 ml稀释至适当倍数，精密量 取稀释后尿液0.3 ml，加入20 l内标液，涡旋混合15 s，加入乙腈0.6 ml，涡旋6

9、0 s，高 速离心(10000 rmin-1)5 min，取上清液50 l进样，样品于-20保存。1.2.5工作曲线制备血浆对照品工作曲线：取头孢匹胺对照 液分别配制成浓度为0.0125，0.025，0.05，0.2，0.4，0.8，1.6 mgml-1的对 照溶液，精密量取上述对照液30 l，于离心试管中，氮气吹干，精密加入空白血浆0.3 ml ，按“血浆样品预处理”项下操作，内标法测定。尿液对照品工作曲线：取头孢匹胺对照液分别配制成浓度为0.025，0.05，0.1，0.2，0.4， 0.8，1.6 mgml-1的对照溶液，精密量取上述对照液30 l，于离心试管中，氮气 吹干，精密加入空白

10、尿液0.3 ml，按“尿液样品预处理”项下操作，内标法测定。2实验结果2.1色谱行为见1，2。1头孢匹胺色谱A-空白血浆；B-血浆加头孢匹胺标准品；C-血样；1-头孢匹胺；2-内标2头孢匹胺色谱A-空白尿液；B-尿液加头孢匹胺标准品；C-尿样；1-头孢匹胺；2-内标2.2工作曲线的线性关系及检测限头孢匹胺血样工作曲线：以头孢匹胺与乙酰苯胺的峰面积比值Ai/As对头孢匹胺血浆标准品 浓度进行回归分析，得标准曲线为Y0.008437X-0.0007713，r=0.9998，线性范围 1.25160 gml-1，最低检测限为0.25 gml-1(S/N3)。头孢匹胺尿液工作曲线：以头孢匹胺与乙酰苯胺

11、的峰面积比值Ai/As对头孢匹胺尿液标准品 浓度进行回归分析，得标准曲线为Y0.003426X-0.001996，r=0.9996,线性范围2. 5160 gml-1，最低检测限为1 gml-1(S/N3)。2.3回收率试验绝对回收率：分别取浓度为10，40，80 gml-1的含药血浆、含药尿液和以流动相 为溶剂配制的化学样品按相应方法进样测定，由血浆和尿液测定的峰面积比与相应化学样品 的峰面积比得出样品的绝对回收率，结果血浆和尿液样品的平均绝对回收率为64.5%和90.5% 。相对回收率：分别配制已知浓度为10，40，80 gml-1的含药血浆、含药尿液，由 实际测定的浓度与理论浓度的比值得

12、相对回收率，结果血浆和尿液样品的平均相对回收率为 99.6%和98.7%。2.4精密度试验取浓度为10，40，80 gml-1的头孢匹胺血浆和尿液样品，于1 d内测定3次，得日 内差，结果平均RSD分别为2.23%和2.72%；取上述样品于3日内重复测定，得日间差，结 果平均RSD分别为3.64%和4.36%。2.5方法稳定性试验取头孢匹胺对照溶液和空白血浆，空白尿液于4周内分4次进行重复配置浓度为10，40，80 gml-1的样品，按相同样品预处理操作，测定，结果平均RSD分别为5.17%和6 .46%，表明方法稳定性良好。3讨论3.1注射用头孢匹胺为头孢匹胺钠，难溶于乙醇，不溶于醋酸 乙酯

13、、氯仿和正己烷，而且其在血浆中蛋白结合率较高，本实验采用10%三氯乙酸作为沉淀 剂，比例为13，结果表明去除蛋白较完全，绝对回收率较稳定。试验中发现沉淀蛋白的时 间以及沉淀剂的浓度和比例对绝对回收率有较大影响，作者认为这和药物与血浆中白蛋白的 游离-结合平衡有关。3.2血浆样品沉淀蛋白后用乙醚除去剩余的三氯乙酸，可将头 孢匹胺峰的理论塔板数提高1倍，而且可减轻三氯乙酸对头孢匹胺峰的延迟影响。3.3头孢匹胺为一种非肾消除途径为主的抗菌素4， 主要以原形药物经胆汁排泄，其在人尿液中的排泄率为给药量的20%25%，静注1 g头孢匹 胺，1224 h后人的尿液中仍可保持约50 gml-1的高浓度，头孢

14、匹胺在人体各组 织和分泌液中的浓度均较高，尤其在女性生殖系统、腹腔内渗液、皮肤和烧伤组织以及痰液 中分布良好，但浓度差异较大。本法灵敏度略低于微生物法，但仍可满足体内药物分析的要 求。陈志刚（北京积水潭医院药剂科，北京 100035）甄健存（北京积水潭医院药剂科，北京 100035）张同合（北京积水潭医院药剂科，北京 100035）参考文献1Demotes Mainard F,Vincon G,Jarry C,et a l.Micromethod for the determination of cefpiramide in human plasma and urine b y high-pe

15、rformance liquid chromatography using automated column switchingJ. J Chromatogr,1987,Aug 7:419.2Nakagawa T,Oda Y,Shibukawa A,et al.Se paration and determination of cefpiramide in human plasma by electrokinetic chro matography with a micellar solution and an open tubular-fused silica capillary J.Chem Pharm Bull,1988,38(4):1622-1625.3刘文英.生物样本中药物测定前的处理技术A .见：刘文英主编.药物分析实验与指导M.北京：中国医药科技出版社，1993，2853