变形杆菌属环介导等温扩增(LAMP检测猪肉硕士论文

1、环介导等温扩增技术快速检测变形杆菌属的研究  【关键词】 变形杆菌属; 环介导等温扩增(LAMP); 检测; 猪肉; 【英文关键词】 Proteus; loop-mediated isothermal amplification(LAMP); detection; pork; 【中文摘要】 病原微生物与食品污染构成了一个巨大并不断扩大的世界性公共卫生问题。我国食源性疾病监测网的统计数字显示:近十年来,由病原微生物引起的食源性疾病事件和涉及的人数最多占46.4%,其中变形杆菌属占11.3%,普通变形杆菌和奇异变形杆菌是引起食物中毒的主要变形杆菌。因此,普通变形杆菌和奇异变形杆

2、菌的检测、鉴定以及防控技术已经受到极大的关注。变形杆菌属的检测方法一直沿用过去传统培养法,己不能适应现代快速检测的要求。 环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是日本学者Notomi等于2000年发明的一种全新的核酸扩增方法。该技术利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下,特异、高效、快速地扩增核酸。在1 h内扩增效率可达到109-1010个数量级,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成

3、的阶梯式图谱。另外,在反应中添加特异性环引物(loop primer)能够把扩增时间缩短到原来的一半,使反应速率极大地得到提高. 【英文摘要】 Pathogenic microorganisms and food contamination constitute a large and growing public health problem worldwide. Monitoring network of food-borne disease statistics: over the past decade, caused by the pathogenic microorganisms

4、and foodborne disease events involving the largest number of 46.4%, which accounted for 11.3% of Proteus, Proteus vulgaris and Proteus mirabilis Is the major cause of food poisoning Proteus. Therefore, Proteus vulgaris and Proteus mirabilis in the detection, identification, and preve.摘要 4-6 Abstract

5、 6-7 1 引言 11-29 1.1 立题的背景和意义 11-12 1.2 变形杆菌属的简介 12-14 1.2.1 变形杆菌属生物学性状 12-13 1.2.2 变形杆菌属的抗原构造 13 1.2.3 变形杆菌属的毒力因子 13-14 1.2.4 变形杆菌属的致病性及临床表现 14 1.3 变形杆菌属的检测研究现状 14-18 1.3.1 变形杆菌属的国标检测方法 14-15 1.3.2 变形杆菌属的传统检测方法 15 1.3.3 基于生化反应的检测方法 15-17 1.3.4 基于血清学的检测方法 17 1.3.5 尿素酶快速试纸法 17 1.3.6 全自动仪器分析系统检测法 17 1.

6、3.7 变形杆菌的PCR 检测方法 17-18 1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术及应用 18-28 1.4.1 LAMP 方法的概述 18 1.4.2 LAMP 方法的特点 18-19 1.4.3 LAMP 方法的引物设计 19-21 1.4.4 LAMP 方法的基本原理 21-25 1.4.5 LAMP 的反应体系 25 1.4.6 LAMP 反应产物的检测方法 25-26 1.4.7 LAMP 方法在食品安全检测中的应用 26-28 1.5 研究内容 28-29 2 材料与方法 29-40 2.1 试验材料 29-31 2.1.1 试验菌株 29 2.1.2 仪器与设备 29 2.1

7、.3 主要培养基 29-30 2.1.4 样品与生化试剂 30-31 2.2 试验方法 31-33 2.2.1 变形杆菌属的培养 31 2.2.2 变形杆菌属基因组DNA 的提取 31-33 2.3 引物设计、体系和操作程序 33-34 2.3.1 LAMP 引物设计 33 2.3.2 LAMP 和PCR 反应体系 33-34 2.3.3 LAMP 和PCR 操作程序 34 2.4 LAMP 产物的检测 34 2.4.1 LAMP 产物的可视结果 34 2.4.2 凝胶成像方法检测LAMP 产物 34 2.4.3 LAMP 产物酶切结果分析鉴定 34 2.5 LAMP 检测条件优化 34-36

8、 2.5.1 适宜Mg(2+)浓度选择 34-35 2.5.2 dNTPs 浓度的优化 35 2.5.3 反应温度的优化 35 2.5.4 引物添加量的优化 35 2.5.5 引物缺省试验 35 2.5.6 反应时间的优化 35-36 2.5.7 BST 酶的优化 36 2.6 引物特异性的检测 36 2.7 变形杆菌属的灵敏度检测 36 2.7.1 LAMP 检测变形杆菌属纯培养的灵敏度 36 2.7.2 PCR 检测变形杆菌属纯培养的灵敏度 36 2.8 人工污染猪肉中变形杆菌属基因组 DNA 提取方法比较 36-39 2.8.1 普通热裂解的方法 36-37 2.8.2 化学试剂法 37

9、 2.8.3 蛋白酶 K 法 37-38 2.8.4 试剂盒法（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0） 38-39 2.9 人工污染猪肉的检出限 39-40 2.9.1 人工污染猪肉及模板DNA 的制备 39 2.9.2 LAMP 法检测人工污染变形杆菌属样品的检出限 39 2.9.3 PCR 法检测人工污染样品的检出限 39-40 3 结果与分析 40-50 3.1 LAMP 反应条件的优化 40-44 3.1.1 Mg(2+)浓度的优化 40 3.1.2 dNTPs 浓度的优化 40-41 3.1.3 反应

10、温度的优化 41 3.1.4 引物添加量的优化 41-42 3.1.5 引物缺省试验 42 3.1.6 反应时间的优化 42-43 3.1.7 BST 酶的优化 43-44 3.2 LAMP 扩增产物的分析 44-45 3.2.1 LAMP 扩增的可视结果分析 44 3.2.2 LAMP 扩增产物的电泳分析 44-45 3.2.3 LAMP 扩增产物的电泳分析酶切 45 3.3 引物特异性的研究 45-46 3.4 PCR 产物测序 46-47 3.5 变形杆菌属纯培养灵敏度的研究 47-48 3.5.1 LAMP 检测变形杆菌属的灵敏度 47 3.5.2 PCR 检测变形杆菌属的灵敏度 47-48 3.6 LAMP 检测人工污染的变形杆菌属DNA 提取方法比较 48 3.7 人工污染猪肉中变形杆菌属检出限的研究 48-50 3.7.1 LAMP 检测人工污染猪肉中变形杆菌属的检出限 48-49 3.7.2 PCR 检测人工污染猪肉中变形杆菌属的检出限 49-50 4 讨论 50-53 4.1 环介导等温扩增(LAMP)方法检测变形杆菌属方法学评价 50 4.2 靶基因的选择 50-51 4.3 LAMP 引物的确定 51 4.4 LAMP 反应条件的优化 51-52 4.4.1 Mg(2+)的浓度 51 4.4.2 DNA 聚合酶 51-52 4.4.3 退火温度对LAM