神经元的再生

1、操纵神经元生长锥来促进轴突越过抑制剂分子再生由于在受到伤害后体内成熟的神经元的轴突生长能力的降低和体外环境中不利的抑制因子的影响，中枢神经系统中的神经元不能使轴突再生。最近的研究显示，标记一组特殊的体外抑制因子来触发长距离的神经轴突的再生是不可行的。为了代替对生长起反作用这个缺陷，解决一个普通的目标能够调节轴突的生长抑制提供一个不同寻常的策略去促进轴突的再生。神经元生长椎可以使轴突伸展，是最多的终端聚集靶点，即使不是全部，在中枢神经系统中也会妨碍轴突生长。在这项研究中，我们准备通过直接调节圆锥细胞的生长来促进轴突的再生。在这里我们用药理学的抑制或肌球蛋白的基因沉默来显著的促进轴突的再生而不是任

2、意和非许可的酶作用物，就像主要的中枢神经系统抑制剂如硫酸软骨素蛋白聚糖和髓鞘相关抑制剂。我们发现肌球蛋白抑制剂能使肌动蛋白和微管在生长锥里重组，从而使微管改编允许快速轴突伸展超过抑制剂培养基。除了增进轴突的伸展之外，我们得到肌球蛋白在轴突里活性的局部封闭可以引发轴突越过自由抑制剂的边界而生长。同时，我们的研究提示肌球蛋白和生长锥细胞支架的成分是促进轴突再生的有效靶点。1. 微管伸展到生长锥的边缘是轴突生长的基本过程，因为当连接到一个退化的肌动纤维时微管会自动远离重要边缘，我们为了测试通过抑制NM的活性来使流动的肌动蛋白获得能量是否能够提高轴突的生长能力而做了以下实验。Fig.1封锁肌球蛋白的活

3、性促进轴突的再生胎儿的DRG神经元培养在任意培养基（单独的多聚赖氨酸或多聚赖氨酸加层粘连蛋白）或抑制剂培养基（CSPGs或聚集蛋白聚糖）有或没有blebbistatin或Y27632作为标记。神经元被固定（在多聚赖氨酸里2022小时后固定，在其他所有的培养基里1214小时后固定）和用TuJ1抗体做免疫组化。测量轴突的长度（A和B）与典型的图片（C，TuJ1抗体做免疫组化的反向图片）。（DF）出生后的小脑小颗粒神经元被培养在多聚赖氨酸，聚集蛋白聚糖或髓鞘提取物在有或没有blebbistatin作为标记。测量轴突的长度（D和E）与典型的图片（F）。当NM的活性被抑制后，我们发现胎儿的背部根神经节在

4、任意培养基中轴突生长能力随着剂量依赖方法提高了。令我们惊喜的是，NM的活性被封锁后不能使神经元完全克服由CSPGs引起的轴突生长抑制作用。我们也观察到CSPGs和聚集蛋白聚糖的抑制效果，通过Y27632，有些CSPGs的作用有所缓解。2. 接下来我们检验了一下如果NM的抑制能够提高成人神经元的轴突生长能力，那哪一些与轴突的再生更相关呢？我们做了以下实验。Fig.2. 肌球蛋白的抑制引起来自成人的DRG神经元的强大轴突在聚集蛋白聚糖里的伸展。（A和B）来自条件损伤小鼠的成人DRG神经元培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基或聚集蛋白聚糖里有或没有blebbistatin 或Y27632，作为标记。测

5、量轴突的长度（A）和典型的图片（B）。（CE）成人的DRG神经元用venus和siRNAs转染来对抗NMA(siNMA)和B(siNMB)做标记。在转染4天后，收集神经元做蛋白质印记（C），或在多聚赖氨酸加层粘连蛋白电镀或聚集蛋白聚糖允许轴突再生长（D和E）。典型的免疫印记（C）和用venus和siRNAs转染神经元的电镀图（E中的箭头）显示的。测量的轴突的长度在D中。*P < 0.05; *P < 0.01; *P < 0.001; n.s., not significant。这些结果暗示，在任意培养基中封闭NMA的活性可以对由blebbistatin引起的轴突生长促进作用

6、有很大的关联，然而在抑制剂培养基中，轴突的生长促进作用是由NMA和NMB共同抑制的结果。然而，在这个研究中被用到的电镀过程与神经元中NM抑制不断生长的轴突或有长轴突的神经元的表达作用不同，这是因为NM在生长锥中的转向可能是不同的。3. 为了了解哪一个NM调控轴突的生长的细胞机制，我们首先检验了一下NM亚型在生长锥里的局部化情况。Fig.3. NMA和NMB在生长锥中的定位。（A和B）培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基中的胎儿的DRG神经元用鬼笔环肽和NMA或NMB抗体染色。指出肌动蛋白的弧形结构和NM亚型的局部翻译被blebbistatin的应用所减少。 结果显示在生长锥细胞中NMA的免疫染色

7、结果和NMB相比效果不显著。在过渡区域NMA的局部与NMB很相似，但是在神经末梢区域NMA与肌动蛋白纤维也结合。NM亚型在过渡结构域的特殊的局部与它们在生长锥中调节退化的肌动纤维的作用是一致的，并且NM局部的明显减少是对blebbistatin的效果提供一个了解blebbistatin结构的基础。4. 为了更进一步的研究哪一个NM抑制导致了轴突生长增强的分子机制，我们检验了生长锥的细胞骨架结构和它们在应答blebbistatin时的结构改编情况，做了以下实验。Fig.4. NM抑制引起生长锥细胞支架结构的改编。（AE）培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基中的胎儿的DRG神经元（A和C）或聚集蛋白

8、聚糖（B和D）有（C和D）或没有（A和B）blebbistatin用鬼笔环肽和tublin抗体染色。每一张图片暴露的时间随着增加肌动蛋白的能见度而调整。典型的图片（AD）和生长锥结构的量化（E）。（F和G）成人的DRG生长锥典型的图片。成人的DRG神经元培养在多聚赖氨酸加多聚赖氨酸（F）或聚集蛋白聚糖（G）有或没有blebbistatin作为标记，并且用鬼笔环肽和tublin抗体染色。 NM的抑制把微管从扁长型的结构释放出来并且允许微管朝着主要边界伸展，结果导致生长锥的细胞支架结构与在任意培养基中类似。5为了检验通过NM抑制如果引起细胞骨架的改编从而影响轴突的生长速率，我们通过时间间隔显微镜来

9、分析轴突的生长。Fig.5.轴突的伸展促进CSPGs产生通过NM抑制要求肌动蛋白和运输动力学。成人的DRG神经元来自于条件损伤小鼠在CSPGs里电镀并且第一次用blebbistatin或DMSO处理作为一个对照组。处理了13个小时后，细胞松弛素D或噻氨酯哒唑加入blebbistatin包含培养并且再另外培养8个小时，显示细胞松弛素D或噻氨酯哒唑完全阻止了当加入blebbistatin后积极伸展的轴突的促进效果。然而那些只用blebbistatin处理的神经元在继续伸展。 结果支持blebbistatin促进轴突生长，CSPGs直接影响生长锥细胞支架结构。6.为了成功的再生，轴突的装配必须越过有

10、抑制剂的培养基，但是在进入抑制剂区域损害轴突之前，它们遭遇了任意抑制剂环境的边界。扩展轴突穿过相同抑制剂涂层的能力也许没有必要转化成穿过抑制剂边界的能力。为了解决这个问题，我们改进了一种两隔间的培养瓶来检验。Fig.6.在轴突中NM的活性局部的封锁后允许生长锥穿过抑制剂边界。（A）两个分区限制的图片。（B）典型的图片关于成人的DRG神经元营养障碍生长锥到达任意的抑制剂边界。（C）轴突在任意抑制剂边界的典型图片。显示轴突离开了微型通道没有进入CSPG涂层轴突隔间而是稍微的沿着边界伸展（红色箭头）或向后调整方向又进入微型通道（黄色箭头）来避免CSPG。（D和E）成人的DRG神经元培养在两隔间里，并

11、且只在轴突的边缘有blebbistatin局部接触。生长在不同隔间的神经元在同一时间染色来确定生长在轴突隔间里的轴突的数量。典型的图片（D）和量化的（E）是轴突进入轴突隔间的情况，*P < 0.01。讨论：多种中枢神经系统抑制剂在阻断了NMII在中枢神经系统和周围神经系统中的活性后，能够加速轴突的生长。尽管NMII的活性能够被ROCK调控，但是NMII抑制剂的促轴突生长的作用好像是独立于Rho-ROCK通路。与NMII抑制剂呈现鲜明对比的是， ROCK通路的阻断对轴突生长几乎没有作用，无论是在聚集蛋白聚糖方面还是在CSPs方面，尤其是在成熟的神经元中在repulsive guidance

12、 cues（不会翻译）和中枢神经系统抑制剂的作用下，Rho-ROCK通路能够调控生长锥的萎缩。但是主要通过诱导肌动蛋白细胞骨架的重排而不是MTs已被广泛认为的中枢神经系统抑制剂的慢性轴突生长抑制作用体现在生长锥急性萎缩上，然而目前的研究清楚地表明急性生长锥萎缩与慢性轴突生长抑制是两种机制截然不同的事件，表明了基于MT和基于肌动蛋白的生长锥的反应，随后轴突生长能够被区分。在最近的研究中我们显示聚集蛋白聚糖阻止微管在生长锥里的伸展并且抑制NM从扁长型的组织里释放这些微管并且引起这些微管朝着重要的边界伸展。尽管blebbistatin显示可以在任意的培养基中促进微管朝着生长锥的边缘伸展（39），它是

13、怎样调节生长锥的细胞支架结构的和随后的轴突在中央神经系统抑制中的生长情况，据我们所知，还没有被探索过。在肌动蛋白结构重组和生长锥降低F肌动蛋白水平的基础上，它很可能轴突的伸展促进效果是NM抑制在抑制剂培养基中重现通过增加微管朝着生长锥的主要边界伸展，这可以作为退化的肌动蛋白排出减少和肌动蛋白弧形结构丢失的一个推论。生长锥微管的结构可以与轴突伸展率结核起来。在任意培养基中，微管张开的结构可以经常被观察到在缓慢推进生长锥，然而在聚集蛋白聚糖里这种成圈的结构会被观察到当生长锥在一个停顿的情况下。我们观察到的这些来自条件损伤小鼠生长锥中牢固的微管结构和blebbistatin处理的神经元是特有的快速推

14、进的生长锥。在轴突生长期间，它变得越来越多的可被观察到，微管功能不仅作为结构上的架子，而且是控制生长锥动力学的直接的传感器和调节器。通过改变微管的结构和动力学，微管的活性相互作用和与细胞支架上其他的成分之间的协调性改变了轴突的生长。关于层粘连蛋白，blebbistatin显示是减少，而不是促进胎儿神经元轴突的生长。这看起来是与先前的研究矛盾的并且我们应该是由于与他们在底层上有差异导致的。在我们的研究中，神经元被培养在多聚赖氨酸（100ug/ml）加510ug/ml层粘连蛋白，然而其他的研究是用更高浓度的层粘连蛋白（25ug/ml）而没有多聚赖氨酸或有很少一点粘着性的培养基。NM抑制轴突生长的最终结果是效果超过了依赖可粘着的任意培养基，但是这个问题更深一步的研究还要继续。修复被损伤的轴突的主要策略是在损伤点构建一个桥梁通过促进长距离的轴突再生。在生长锥里调节轴突装配和soma里基因的表达对于促进轴突生长同样重要。因为生长锥细胞支架结构的改变直接影响轴突伸展的速度，接触调节生长锥微管提供一个策略不仅允许轴突越过复杂的中枢