姜黄素自微乳化给药系统的体内外评价

1、姜黄素自微乳化给药系统的体内外评价         10-11-15 11:09:00     编辑：studa20                  作者：吴雪梅 张晶 许建华 黄秀旺 宋洪涛 温彩霞 【摘要】  目的 将姜黄素（Cur）制成自微乳化给药系统，并对其进行体内外评价。 方法

2、 测定乳化后乳剂的pH值、自乳化时间、粒径、形态特征、稳定性和体外释放度，考察Cur自微乳化给药系统在小鼠体内的药物动力学过程，并与其混悬剂相比较。 结果 Cur自微乳化给药系统可在4 min内乳化完全，乳化后的微乳pH值接近中性，平均粒径为31.98 nm。以0.25%SDS的纯净水为释放介质，10 min内药物可释放完全。8 h内微乳溶液中Cur的含量保持>94%。小鼠灌胃给药后的药动学过程表明，与Cur混悬液相比，微乳的AUC提高了12倍。 结论 自微乳化给药系统可显著提高Cur的体外溶出度和体内生物利用度。 【关键词】  姜黄素； 药物释放系统； 溶解度； 生物利用度A

3、BSTRACT:  Objective  To prepare the curcumin selfmicroemulsifying delivery system and to evaluate the quality in vivo and in vitro.  Methods  The pH, selfemulsification time, particle size, morphology, stability and dissolution of the resultant emulsion after selfemulsifying were

4、 determined.  The plasma concentrations were determined by HPLC and the pharmacokinetics behavior of curcumin microemulsion was evaluated by comparison with suspension.  Results  The curcumin selfmicroemulsifying delivery system can emulsified completely within 4 min.  Mean parti

5、cle size of the resultant emulsion was 31.98 nm, and pH approximated to neutral.  The dissolution of curcumin selfmicroemulsifying formulation at 10 min was 100% and the content of drug maintained above 94% with 8 h.  Compared with suspension, the area under timeconcentration curve (AUC) o

6、f microemulsion after gavage increased 12fold.  Conclusion  The selfmicroemulsifying delivery system can significantly increase curcumin dissolution in vitro and bioavailability in vivo.    KEY WORDS:  CURCUMIN; drug delivery systems; solubility; biological availability

7、    福建医科大学学报  2010年6月  第44卷第3期吴雪梅等：姜黄素自微乳化给药系统的体内外评价姜黄素(Curcumin,Cur)为常用中药材姜黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用，特别是抗肿瘤作用备受关注1。Cur溶于乙醇而不溶于水，体内吸收差，生物利用度低，其药理活性研究很活跃，但制剂的研究相对较少2。近来文献报道了将Cur制成环糊精包合物和固体分散体的研究34。自微乳化给药系统（selfmicroemulsifying delivery system, SMEDDS）是由油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的均

8、一体系，药物呈分子状态溶解于其中，该体系在胃肠道中或轻柔搅拌下能够自发形成粒径<100 nm且分布均匀的微乳，具有很大的比表面积，能够大大提高药物的溶出度，从而提高生物利用度5。本研究将Cur制成SMEDDS，并进行了体外质量评价；同时以Cur的CMCNa混悬液为对照，采用小鼠研究其体内药物动力学过程，以考察该剂型对药物生物利用度的提高情况。1  材料与方法1.1  材料1.1.1  动物 小鼠，雄性，体质量（20±2）g, 福建医科大学实验动物中心提供合格证号：SCXK (闽) 200420002。1.1.2  主要试剂与仪器

9、 Cur（上海国药集团化学试剂有限公司, 批号：F20050102）；羧甲基纤维素钠（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F2001128）；Cur对照品（中国药品生物制品检定所,批号：08239802）；LC20AB高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）；JEM 透射电子显微镜(日本电子公司)；D800LS智能药物溶出仪（天津大学无线电厂）；UV2450紫外分光光度计（岛津公司）；XW80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)；高速离心机（雅培公司）；Nicomp380/ZLS激光粒度与电位测定仪(美国Nicomp公司)；HI98107笔式酸度计（意大利哈纳公司）；乙睛(色谱纯，Merc

10、k公司)；其他试剂为分析纯。1.2  方法1.2.1  Cur SMEDDS的处方优化 选择肉豆蔻酸异丙酯为油相，聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40为表面活性剂，乙醇为助表面活性剂作为Cur SMEDDS处方中的辅料。将选择的油相、表面活性剂、助表面活性剂配制成一系列不同比例的自乳化浓缩液，称取约1 g，加入药物，滴加至100 mL 37 的蒸馏水中，100 r/min温和搅拌，使自乳化浓缩液在外界动力下形成乳液，当体系恰好澄清时，记录各组分的量，绘制三元相图，并测定各处方所形成微乳的粒径。1.2.2  pH值 在室温条件下，将Cur SMEDDS按1

11、10进行稀释，形成微乳，测定其pH。1.2.3  自乳化效率考察 将Cur SMEDDS 1 g分别加入100 mL (37±1)的纯净水、0.1 mol/L HCl缓冲液和pH 6.8 PBS缓冲液中，100 r/min恒温水浴中搅拌。分别在0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,5,6,7,8,10 min取样，放置室温。取3 mL乳化的液体在550 nm处测其各时间点的At值，以10 min测得的吸收值（A0）作为100%。计算各时间点A值的相对百分数(At/A0)，以各时间点的(At/A0)对时间t作图。散色光强度达到最大值A的90%所对应的t作为

12、体系的相对自乳化时间。1.2.4  乳滴粒径的测定 采用激光粒径电位测量仪测量乳化后形成乳液的粒径分布。1.2.5  形态观察 取自乳化浓缩液，蒸馏水稀释500倍，制备微乳液。将微乳滴于铜网上，用2%磷钨酸负染1 min，透射电镜下观察乳滴的形态。1.2.6  体外释放度研究 参照中国药典溶出度测定法（2010版二部附录XD第二法），以900 mL含0.25% SDS的纯净水为释放介质。称取CurSMEDDS浓缩液0.2 g(含Cur 10 mg)、Cur粉末10 mg，将其滴入或平撒在释放介质中，在100 r/min、(37

13、7;l)恒温水浴中搅拌。分别在5,10,20,30,40,60 min取样1 mL，取样同时补加1 mL释放介质。取出的样品立即以10 000 r/min离心5 min，取上清液，HPLC法测定其中的药物浓度，计算药物累积释放量及累积释放量百分率。1.2.7  稳定性试验1.2.7.1  低温试验和常温试验 将Cur SMEDDS浓缩液一批置于4 冰箱中放置7 d、室温下放置1月，观察外观并测定含量。1.2.7.2  自微乳化后的溶液稳定性 取Cur SMEDDS 200 L,分别加入100 mL 水、0.1 mol/L HCl、pH 6.8

14、PBS中，振摇使其自乳化完全后，分别在室温25，37 条件下，于0,1,2,3,4,6,8 h观察微乳溶液状态并于溶液上层取微乳溶液，用0.45 m微孔滤膜过滤，应用HPLC法测定并记录样面积(Ai)，计算不同时间Cur峰面积相对于0 h(A0)的百分数(D)，以反映样品中药物含量变化情况。同时取微乳溶液测定其中纳米乳滴的粒径，以评价其物理稳定性。1.2.8  体内药动学研究 小鼠随机分成2组，每组50只。实验组予以Cur SMEDDS，为方便小鼠灌胃给药，给药前加入适量蒸馏水稀释，制成浓度为10 mg/mL的Cur微乳，混匀备用。对照组以Cur混悬液(以0.5%的羧甲基纤

15、维素钠混悬)灌胃，剂量为200 mg/kg，于给药后5，10，20，30和45 min，1，1.5，2，3和4 h各取5只小鼠，眼眶取血(约0.6 mL)于肝素抗凝管中，立即10 000 r/min离心 10 min分离并吸取血浆200 L，20 冰箱中保存备用。1.2.8.1  色谱条件 色谱柱：Kromasil 100 A C18柱 (200 mm×4.6 mm，粒径5 m，迪马公司)；流动相：乙腈5冰醋酸水溶液(5149，V/V)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：428 nm；柱温：30 ；进样量：25 L。1.2.8.2  血浆样品的处理方

16、法 精密量取小鼠血浆180 L，加入20 L Cur对照品溶液，涡旋振荡混匀，加入500 L乙酸乙脂，涡旋混合3 min， 10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，在余液中再次加入500 L乙酸乙脂，涡旋振荡3 min，10 000 r/min离心5 min，取上清夜，合并两次上清液，室温条件下通氮气吹干，残余物加100 L流动相复溶，涡旋振荡2 min，10 000 r/min离心5 min后取上清液进样测定。1.2.8.3  方法专属性考察 将小鼠空白血浆样品、空白血浆中加入标准品以及血浆样品的色谱图相对照，考察方法专属性。1.2.8.4 

17、; 标准曲线的制备 精密量取小鼠空白血浆180 L，加入Cur对照品溶液20 L，涡旋混合，得到浓度为21，42，84，168，252，336，420 ng/mL的血浆样品。按血浆样品处理项下方法操作，进样25 L，记录色谱图及峰面积，以Cur峰面积（A）为纵坐标，待测物浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。1.2.8.5  精密度和回收率试验 取空白血浆180 L，分别加入不同浓度Cur标准品溶液20 L，涡旋混合，制成31.5，168，378 ng/mL的样品，每个浓度制5份。按血浆样品处理项下方法操作，于<1 d测定5次，求算日内精密度；于5 d中分别取高

18、、中、低3个不同浓度样品同法操作，计算日间精密度。    方法回收率实验：将浓度为31.5，168，378 ng/mL的血浆样品，按血浆处理项下方法操作，记录峰面积（A）。将A代入标准曲线方程计算测得量，以测得浓度与实际浓度之比计算方法回收率(%)。    提取回收率试验：将浓度为31.5，168，378 ng/mL的血浆样品，按血浆处理项下方法操作，记录峰面积（A1）。另用流动相配制相同浓度的标准品溶液直接进样，记录峰面积（A2），A1与A2之比即为提取回收率。     10-11-15 11

19、:09:00     编辑：studa201.2.8.6  血药浓度测定和药动学参数计算 将血样按上述血浆样品处理项方法处理后，进样25 L测定血浆中Cur的含量。根据测得的血药浓度数据，绘制微乳组与对照组的平均血药浓度-时间曲线。将得到的血药浓度结果用DAS软件拟合分析，计算药动学参数。以下列公式计算Cur微乳溶液和混悬液小鼠灌胃给药后的相对生物利用度：    F(%)= AUC(0-) Microemulsion/ AUC(0-)Suspension×100%2  结果2.1

20、60; Cur SMEDDS的处方优化 根据假三元相图（图1）和相图中各处方的粒径分布，Cur SMEDDS优化处方为肉豆蔻酸异丙酯乙醇聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 =202060，每l g中含有药物50 mg。采用溶解法制备Cur自乳化给药系统。按IPM乙醇聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 226称取辅料，混合均匀。按辅料量的5%加入Cur，涡旋混合至药物全部溶解即得。2.2  pH值 微乳体系pH值为6.27，说明Cur微乳体系的酸碱度接近中性。2.3  自乳化效率考察 Cur SMEDDS在水、0.1 mol/L HCl缓冲液和pH 6.8 PB

21、S缓冲液中的相对自乳化时间分别约为3，4，1 min。将三者的自乳化时间进行比较，由此可得出三者之间自乳化效率的高低关系，即pH 6.8 PBS缓冲液纯净水0.1 mol/L HCl缓冲液(图2)。2.4  乳滴粒径的测定 Cur SMEDDS乳化后乳滴的平均粒径为（31.98±15.9）nm（Gaussian分布）、（27.54±3.5）nm(Nicomp分布)；Nicomp分布为单峰(图3)。2.5  形态观察 电镜照片显示，自乳化形成的乳滴形态呈圆球型，大小均匀，相互之间无粘连，粒径大小在50100 nm（图4）。2.6

22、0; 体外释放度研究 Cur SMEDDS的释药速度很快，<10 min即将药物全部释放完全，而Cur本身不能完全释放出药物，60 mim时药物仅释放出40%左右(图5)。2.7  稳定性试验2.7.1  低温试验和常温试验 将Cur SMEDDS浓缩液放置于4 冰箱放置7 d、室温条件中1月，观察其外观仍为深红色澄清、均一溶液，无药物晶粒析出，也无分层现象。测定浓缩液放置前后的药物含量，未有明显的降低。2.7.2  自微乳化后的溶液稳定性  自乳化溶液8 h内的稳定性见表1。表1  Cur SMEDDS在水、0.1

23、M HCl、pH 6.8 PBS中自微乳化后的稳定性（略），Tab 1  Stability after selfemulsifying in water, 0.1 mol/L HCl, pH 6.8 PBS介质T温度/t/h0123468水25澄明度含量(略)2.8  体内药动学研究2.8.1  方法学考察 色谱行为表明，Cur的保留时间约为9.5 min，内源性物质及代谢产物不干扰药物的测定(图6)。Cur的血浆样品标准曲线方程为：    A=296.54C+1853.1，r0.9940   

24、; 表明在21420 ng/mL浓度范围为其线性关系良好。低、中、高3个浓度样品的日内精密度RSD分别为4.25%，3.77%和3.19%，日间精密度RSD分别为7.88%，4.07%和7.24%，方法回收率分别为98.29%、93.01%和96.30%，提取回收率率分别为86.34%、89.49%和80.85%。2.8.2  血药浓度测定和药动学参数计算 Cur微乳和混悬液单次灌胃给药后的平均血浆药物浓度-时间曲线如图7所示。相同剂量下的Cur微乳溶液和混悬液小鼠灌胃给药的药动学过程符合单室模型(权重系数1) ，其药动学参数见表2。微乳给药后AUC明显增大,计算求得微乳溶

25、液对混悬液的相对生物利用度为1273.25%，即微乳溶液的生物利用度为混悬液的12倍左右。表2  Cur微乳和混悬液给药后的药物动力学参数（略），Tab 2  Main pharmacokinetics parameters of curcumin microemulsion and suspensionParametersUnitMicroemulsionSuspensiont（略）3  讨论    本研究制备了Cur自乳化给药系统并进行体外质量评价，证实该制剂自乳化能力较强，乳化后的乳液粒径小而均匀，但透视电镜测定的粒径结果与激光

26、粒径仪所得结果不同，可能是由于两者的测定原理不同所致67。SMEDDS所形成的微乳为热力学及动力学均相对稳定的体系，从物理稳定性看，8 h内微乳溶液在三种介质条件下一直呈澄清的溶液状态，但随着时间的延长，粒径呈增大均势，这是由于微乳粒子一直在进行布朗运动，粒子相互碰撞，出现粒子聚集甚至聚合情况，使微粒增大。在后续试验中，将该溶液放置>1 d，出现油滴上浮现象，说明微乳依旧存在着相对不稳定性。从化学稳定性看，8 h内溶液中药物含量保持>94%，说明该溶液比较稳定，该研究结果与文献报道相一致8。由含量变化情况看，在0.1 mol/L HCl、pH 6.8 PBS中，37 下微乳中药物的