(整理)可溶性糖测定.

1、精品文档精品文档引言可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一, 尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的 重要因素。对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡， 品质差。因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意 义。而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源， 具有较高的营养价值。本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸 收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定 可溶性糖含量。精品文档精品文档1

2、蒽酮比色法1.1 原理糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含 量有关。在 625 nm 波长下的 0D 值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强 度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。1.2 仪器与材料1.2.1 实验仪器分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。1.2.2 实验试剂（1）蒽酮乙酸乙酯试剂： 取分析纯蒽酮 1g,溶于 50ml 乙酸乙酯中， 贮于棕色瓶中, 在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。（2）浓硫酸（比重 1.84）。1.2.3 实验材料植物叶片。1.3 实

3、验方法1.3.1 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 11 支，从 010 分别编号，按表 24-1 加入溶液和水。表1各试管加溶液和水的量管号01、23、45、67、89、10100卩g/ml蔗糖液(ml)00.20.40.60.81.0水(ml)2.01.81.61.41.21.0蔗糖量（卩g）020406080100然后按顺序向试管内加入 1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入 5ml 浓硫酸， 摇匀。比色液总体积为 8ml，在恒温下放置 30min，显色。然后以空白为参比，在 485nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方 程。按表

4、 1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml 蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml 浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在 630nm 波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。1.3.2 可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取 0.100.30g,共 3 份，或干材料。精品文档精品文档分别放入 3 支刻度试管中，加入 510ml 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取 30min （提取 2 次），提取液过滤入 25ml 容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。1

5、.3.3 显色测定吸取样品提取液 0.5ml 于 20ml 刻度试管中（重复 2 次），加蒸馏水 1.5ml,以下步 骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。1.3.4 结果计算可溶性糖含量（mg/g）=（从回归方程求得糖量/吸取样品液的体积）x提取液量x稀释倍数十样品干重x10-62 铜还原碘量法2.1 原理试剂中的 Cu2+与还原糖作用，生成氧化亚铜（CU2O）沉淀。加入 H2SO4后，氧化亚铜 溶解生成 Cu+,试剂中的 KIO3与 KI 在酸化的同是生成 12。KIO3+5KI+3H2SO4T3K2SO4+3H2O+3I2,然后 Cu+被 12氧化，2Cu+l2 2Cu+ 2I-溶液中

6、剩余的碘以淀粉为指示剂，用N&2S2O3标准溶液滴定：N&2S2O3+ I2Na2S2O6+ 2NaI同时以水代替样试液做空白滴定，将空白与样品的滴定差值带入由滴定标准系列糖 液计算的回归方程中，即可求得所求试样中还原糖的含量。2.2 仪器与试剂2.2.1 实验试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB / T 6682 规定的至少三级水。氢氧化钠溶液碱性铜试剂，盐酸溶液c（HCl）=1mol / L，亚铁氰化钾溶液wK4Fe（CN） 6 H2O=15% ，硫酸锌溶液w（ZnSO4 7H2O） 6 H2O=3O% ,硫酸 +草酸混 合液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠工作溶液

7、 c （ Na2S2O3） =0.005mol / L，淀粉指示 剂，酚酞指示剂，氢氧化钠溶液c （NaOH） =0.5mol/ L，葡萄糖标准液。2.2.2 仪器和设备分析天平，高速组织捣碎机，电磁炉、可调温电炉或恒温水浴锅，25mL 滴定管，（酸式、减式皆可），鼓风干燥箱。2.3 实验方法2.3.1 样品制备（1）新鲜样品：取有代表性的样品，洗净，把水吸干，用四分法取样，切碎，混 匀，用组织捣碎机匀浆。黄瓜，番茄等多汁蔬菜可直接制成匀浆。其他样品蔬菜可称取 切碎混匀的样品 100.0g,加入 100mL 水制成匀浆，韭菜等水分较少的蔬菜可称取切碎 混匀的样品100.0g，加入 200mL

8、水制成匀浆。去相当于 10g 样品的匀浆，精确到 0.01g, 用水洗入 100mL容量瓶（V1）中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL （如菜豆精品文档精品文档累高蛋白蔬菜可加入 2mL）。摇匀后定容，放置片刻，等沉淀分离后过滤备用。（2） 干制品：将样品至于 63C67C鼓风干燥后，用粉碎机粉碎，过 0.5mm 筛。 去1.00g2.00g 粉碎的样品防雨烧杯中，加入少量水湿润，用水洗入 100mL 容量瓶中， 用沸水浴加热 10min，冷却后，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各 1mL，摇匀后定容， 过滤后备用。（3） 制品各种酱腌菜：去切碎混匀的样品 100.0g，加入 100mL

9、水制成匀浆。蔬 菜罐头可直接制取匀浆， 操作步骤同 5.1。 番茄酱混匀后， 可直接制取 5.00g 样品用水洗 入 100mL容量瓶同 5.1 操作。蔬菜汁称取混匀的样品 20.00g 用水洗入 100mL 容量瓶同 5.1 操作。2.3.2 还原糖的鉴定（1） 标准曲线的制作：用移液管吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 的葡萄糖标 准液与 100mL 锥形瓶中，或 200mmx25mm 的试管中，各加水至 5.0mL，加入 5mL 的 铜试剂，锥形瓶或试管口上加小漏斗，用相应的架子固定，置于沸水浴中加热15mi n。取出后立即置于冷水中，冷却至 25C到 30C。将加盖小

10、漏斗更换为表面皿（不可摇动）。 加入 2mL 硫酸+草酸的混合液，立即摇动，使氢氧化亚铜完全溶解。用硫代硫酸钠工作 溶液滴定至浅黄绿色时，加入约 0.5mL 的淀粉指示剂，滴定至蓝色消失为终点。以糖的 含量（mg）为 y，空白与糖液滴定差值为 x，计算回归方程 y=bx+a 并计算出 a 和 b 的值。 标准曲线于没新配一次铜试剂和硫代硫酸钠储备液制备一次即可。（2） 试样还原糖的测定：根据不同样品中糖的含量， 用移液管吸取 5mL10mL（V2）与 50mL 或 100mL（V3）于容量瓶中.用水定容（含糖量低的样品不作次稀释处理）。从容量瓶中吸取 5.00mL （V5）与锥形瓶或试管中，加

11、入 5.00mL 的铜试剂。以下按 6.1.1 标准 曲线的制作步骤操作。记录滴定值（V4）。同时以水代替试样作空白（可不加热）。将试 样与空白滴定差值带入回归方程即可算出试样中还原糖的含量。如试样与铜试剂加热反应后，砖红色氧化亚铜的含量较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取 1mL4mL 样液，加水至 5.00mL 测定。滴定值应不少于标准曲线的最高点。（3） 试样可溶性总糖测定：用移液管吸取 5mL10mL 与 50mL 或 100mL 于容量 瓶中， 加入 1mL的盐酸溶液， 置于沸水浴中加热 10min， 冷却， 加入酚酞试剂 12滴, 用约 0.5mol/ L 氢氧化钠溶液中和

12、至红色，再用稀盐酸调定红色刚刚消失，定容。以下 按还原糖步骤操作。2.3.3 结果计算试样中可溶性总糖的的含量以质量分数 w1 计，单位以百分率（）表示，计算式 如下：W 仁a+b（V0-V4）xV1xV3/V2xV5xmx10003 费林试剂法3.1 原理精品文档精品文档在沸热条件下，用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时将费林试剂中的二价铜还原精品文档为一价铜,以亚甲基蓝为指示剂，稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无 色的还原型亚甲基蓝。3.2 仪器与试剂3.2.1 仪器设备高速组织捣碎机，电热恒温水浴，1000W 调温电炉，200ml,250ml 容量瓶，250ml 锥形瓶，50

13、ml 碱式滴定管。3.2.2 实验试剂(1)费林试剂甲： 称取硫酸铜(CuSO45H2O,分析纯)34.6g 溶于水中， 稀释至 500ml，过滤，贮于棕色瓶内。(2) 费林试剂乙：称取氢氧化钠 50g 和酒石酸钾钠(KNaC4O6H4 4H2O,分析纯)138g 溶于水中，稀释至 500ml,用石棉垫漏斗抽滤。(3) 转化糖标准溶液：称取 9.5g 蔗糖(分析纯)用水溶解后转入 1000ml 容量瓶中，加 入6MHCl(分析纯)10ml,加水至 100ml。在 2025C下放置三天或在 25C保温 24h，然 后用水定容(此为酸化的 1%转化糖液，可保存 34 个月)。测定时，取 1%转化糖

14、液 25.00ml 放入250ml 容量瓶中，加入甲基红指示剂一滴，用 1MNaOH 溶液中和后用水定 容，即为 1mg/ml转化糖标准溶液。(4) 亚甲基蓝溶液：称取 0.5g 亚甲基蓝(分析纯)溶于 100ml 水中。(5)乙酸锌溶液：称取 21.9g 乙酸锌Zn(OAC)2 2H2O,分析纯溶于水中，加冰 乙酸 3ml，稀释至 100ml。(6)亚铁氰化钾溶液：称取 10.6g 亚铁氰化钾K4Fe(CN)6 3H2O,分析纯溶于水， 稀释至 100ml。3.3 实验方法3.3.1 样品提取液制备取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分 法取样。称取 100

15、g 鲜样加入等重量的水，放入组织捣碎机中捣成1:1 匀浆，有些材料匀浆比例可适当调整，多汁果蔬类可直接捣浆。称取匀浆 25.0 或 50.0g(相当于样品 12.5 或25.0g)放入 150ml 烧杯中，含有机酸较多的材料加 0.52.0g 粉状 CaCO3 调至中性(广 范试纸检试)。用水将样液全部转入 250ml 容量瓶中，并调整体积约为 200ml。置 80 2C水浴保温 30min,其间摇动数次，取出加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各25ml,冷却至室温后，用水定容，过滤备用。3.3.2 可溶性糖测定(1) 费林试剂的标定： 取费林试剂甲、 乙各 5.00ml 或在测定前先等体积混合后

16、取 10.00ml混合液于 250ml 锥形瓶中，放入玻璃珠 45 粒,先加入比预测(按 6.2 进行预测) 仅少 0.5ml的 1mg/ml 转化糖标准液。将此混合液置 1000W 电炉上加热,使其在 2min 左右沸腾,准确煮沸2min,此时不离开电炉，立即加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6 滴,并继续精品文档以每 45s 的滴速滴加标准糖液，直至二价铜离子完全被还原生成砖红色氧化亚铜沉淀，溶精品文档液蓝色褪尽为终点。用准确滴定标准糖液的毫升数 V1,乘以标准糖液浓度 mg/ml, 即得 10ml费林试剂所相当的糖的毫克数。 取已经制备的待测液 100ml 于 200ml 容量 瓶中，加6M

17、HCI10ml。在 80 土 2C水浴加热 10min,放入冷水槽中冷却后，加甲基红指示剂 二滴用 6M及 IMNaOH 溶液中和,用水定容。(2)预测：取费林试剂甲、乙各 5.00ml 或 10.00ml 混合液于 250ml 锥形瓶中，滴定管加入待测糖液约 15ml,在电炉上加热至沸，约沸 15s 后迅速滴加待测糖液，至呈现极轻 微的蓝色为止，此时加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6 滴，继续滴加待测糖液，直至溶液蓝 色褪尽为止，记下待测糖液的用量V2(毫升数)。(3)准确测定：取费林试剂甲、乙各 5.00ml 或 10.00ml 混合液加入锥形瓶中，由滴 定管加入比预测仅少 0.5ml 的待

18、测糖液，并补加 V1 -V2 毫升水(标定费林试剂所消耗 的标准糖液毫升数 V1 减去预测消耗的待测糖液毫升数 V2,即为应补加水的毫升数)，使 其与标定费林试剂时的反应体积一致。以下按费林试剂标定同样操作，继续滴至终点。前后沸热时间须在 3min 左右。待测糖液消耗量应控制在1550ml 范围内，不能大于标定费林试剂所用标准糖液体积 V1。否则应增减称样量重新制备待测液 。3.3.3 结果计算待测液可溶性糖含量()=滴定标准糖液的毫升数/待测液滴定的毫升数4 原子吸收法4.1 原理将样液与过量的碱性铜盐反应，使产生沉淀，然后取上层清液用原子吸收分光光谱 仪测定剩余铜含量，通过标准曲线计算水果

19、蔬菜中可溶性糖含量3。4.2 仪器与试剂4.2.1 实验仪器原子吸收分光光谱仪，电热恒温水浴锅，高效自动阻止捣碎机，电子天平。4.2.2 实验试剂(1) 葡萄糖标准贮备液，5g/L(2) 碱性铜盐溶液(3) 10%中性醋酸铅溶液(4) 6mol/L 氢氧化钠溶液(5) 6mol/L 盐酸溶液(6) 6mol/L 硫酸钠溶液4.3 实验方法4.3.1 工作曲线绘制分别吸取糖标准贮备液 1.0, 2.0，3.0, 4.0，5.0, 6.0ml 于 50 ml 容量瓶中，加入碱 性铜盐溶液 5.0ml，于沸水浴中反应 15min，取出后立即用冷水冷却，定容。静置澄清精品文档精品文档精品文档后，吸取清

20、液再稀释 50 倍，用原子吸收分光光谱仪，铜空心阴极灯于324.8nm 测吸光度，用吸光度和糖浓度值绘制工作曲线。4.3.2 样品测定取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分 法取样，放入高效自动阻止捣碎机捣成匀浆。称取匀浆25g,用约 100ml 水洗入 250ml容量瓶中，摇匀，放入 80 摄氏度水浴保温浸提 30min,期间摇动数次，取出冷却后滴 加中性醋酸铅溶液至不再产生沉淀为止，再加入1-2g 硫酸钠溶液以除去溶液中的过剩铅盐，定容，过滤。吸取清液 50ml 放入 100ml 容量瓶中。加入 6mol/L 盐酸溶液 5.0ml， 于90 摄氏度中水解

21、10min。取出冷却后，用 6mol/L 氢氧化钠溶液中和，用水定容即为 待测液。吸取待测液 5.0ml，按与工作曲线相同程序测定。4.3.3 结果计算X=CXVXFX100式中：X 为样品中可溶性糖含量%；C 为查标准曲线获得的糖浓度值；V 为定容体积；F 为稀释倍数。5 气相色谱法5.1 原理用糖醇衍生化成乙酸酯，用石英毛细管色谱柱对稻子、小麦麸皮样品进行分析测定， 得到样品中可溶性 NSP 各组成单糖的色谱峰，并依据色谱图提供的数据计算样品中可 溶性非淀粉各组成单糖的含量及其总含量。5.2 仪器和试剂5.2.1 实验仪器气相色谱仪，检测器FID，恒温振荡器。5.2.2 实验试剂(1) 无

22、水乙醇，NaBH4，冰醋酸，乙酸酐，氢氧化钾，乙酸乙酯氨水均为分析纯。(2) 标准单糖：木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖，岩藻糖，半乳糖，鼠李糖，均 为 AR级。(3) 实验样品：稻子、小麦麸皮。5.2.3 气相色谱条件(1) 石英毛细管柱，规格为 25mX0.3mm；(2) 起始温度 195C,升温速度 8C/min，最后温度升至 225C；(3) 检测器温度为 250C；(4) 汽化室温度为 210C；精品文档精品文档(5) 分流比为 1:20；(6) 载气 N2;(7) 进气量为 0.8ul。5.3 试验方法5.3.1 样品的前处理将麦子小麦和麸皮分别粉碎后通入0.5mm 的筛子，磨细的粉

23、末加入硅胶保干器中24 个小时，保持湿度，准称样品 100mg 分别放入 8mL 带螺帽玻璃试管中，加入 80%的 乙醇5ml，并加至 80E10min,离心分离，吸出上清液，可除去游离糖，并使内源酶失 活。5.3.2 淀粉与 NSP 的分离在 40C时用 N2 吹干样品，加 20ml 醋酸缓冲液(pH0.5)，加热至 100E30min,搅 拌使淀粉凝胶，冷却至 95C,加入 0.05mla-淀粉酶，恒温震荡，冷却至 55E，加入 0.2mla-葡萄糖苷酶，使样品酶解。将可溶性 NSP 与淀粉分离，离心，取上层清夜做可溶性 NSP 鉴定。5.3.3 可溶性 NSP 的测定取上层清夜 1ml

24、放入 8ml 带螺帽试管中，加 4ml 无水乙醇，充分振荡，离心去 掉上层清夜，剩余物用 N2吹干，加入 1ml 2mol/L 三氟乙酸，加热到 125E，使样品全 部水解，冷却室温，加入 0.1ml 内标物(阿洛糖 500mg/L)。并在混合液中加入 0.2ml 的 无水乙醇，和一滴 3mol/L 的 NH4OH,再加入新配置的 NaBH4,放置于 40C的水浴中，力卩 冰醋酸分解过量的NaBH4，加入 0.5ml 的 1-甲基咪唑和 5ml 乙酸酐反应 10min，然后加 入 1ml 无水乙醇静置10min，分两次加入 10ml7.5mol/L KOH，溶液分为两层，用少量乙 酸乙酯提取有

25、基层 2-3 次且合并。有机层用 N2吹干，所得糖醇乙酸脂可直接进行气相 分析。5.3.4 结果计算X=(样品峰面积x内标物重量x1000X相应因子/内标物峰面积x样品重量)x聚 合因子6 液相色谱-蒸发光散射法6.1 原理不挥发样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比。6.2 仪器与试剂6.2.1 实验仪器高效液相色谱仪；低温型蒸发光散射检测器；高速冷冻离心机；匀浆机；电子分析 天平。6.2.2 实验试剂(1) D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，各种糖标样的纯度均大于 99%。(2) 乙腈为色谱纯试剂。(3) 实验用水为二次蒸馏水。(4) 苹果样品。6.3 实验方法6.3.1 标准溶液的配制精确称取果

26、糖，葡萄糖，蔗糖各 25.0mg 置于 25ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释、定容， 配制成 5mg/ml 混合糖标准液。使用前用蒸馏水稀释成所需浓度的标准工作溶液。精品文档精品文档6.3.2 样品处理准确称取 10g 果肉，研磨后加入 50ml 蒸馏水，于 80C恒温水浴中保温 20min,不 时搅拌，使可溶性糖充分浸出，然后离心和过滤，将滤液全部收集在 100ml 的容量瓶中， 用蒸馏水定容至刻度。待测液用 0.45 m 的微孔滤膜过滤，滤液供 HPLC 分析。6.3.3 绘制色谱图(1)色谱柱：规格为 4.6mmlDx250mm，5 pm；柱温为室温；流动相为 V(乙醇)：V (水)=80:

27、20;流速 0.8ml/min;进样量 5 丄。(2) 蒸发光散射检测器(ELSD)的漂移管温度 40C，氮气作载气，流速 1.5mL/min。6.3.4 结果计算将配好的混合糖标准贮备液依次稀释为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mg/mL的不同浓度混合糖标准溶液，在测定条件下进样5 此，根据测得的峰面积与相应糖的浓度进行线性回归，得到曲线方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5 此，计算当信噪比 S/N=5 时所对应的糖标准溶液的质量浓度以确定检测限5。7 连续流动法7.1 原理用盐酸直接水解样品中的可溶性糖， 然后用连续流动分析仪测定样品中可溶性糖的

28、含量。7.2 仪器与试剂7.2.1 实验仪器连续流动分析仪。7.2.2 实验试剂(1) 试验用水为二级水，其它所用试剂均为分析纯；(2)盐酸溶液：42.4 mL HC1 37% (GR)用水稀释至 1 000 mL，加入 1 mL Brij35 ;(3) 碳酸钠溶液：26.5 g Na2C0 (GR)用水稀释至 1 000 mL,加入 1 mL Brij35。精品文档精品文档(4)盐酸新亚铜溶液：0.4 g 盐酸新亚铜(C14H 3C1N2; GR),力卩 0.2 g CuSO45H20 用水稀释至 1 000 mL，加入 0. 5 mL Brij35。(5) 葡萄糖标准储备液 50mg/mL :称取 50 g 葡萄糖，用水稀至 1 000 mL。用水稀 释配制葡萄糖标准曲线系列：0. 05、0. 2、0. 6、1. 0、2. 0mg/mL。7.3 实验方法7.3.1 样品中可溶性糖的测定称取试样 2.5 g10 g(m2)，置于 250 mL 容量瓶中，加入约 200mL 水充分摇匀，然 后加