细菌提取方法

1、细菌DNA提取方案金葡菌细胞壁厚,不容易破壁.下面我提供几个方法.希望对你有些参考DNA提取的几种方法(1) .浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者别离,常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提居到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细月破碎液除去RNP再以IMNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白.两种方法比拟,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,参加适量去污剂,如SDS可有助于

2、蛋白质与DNA的别离.在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中参加柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.(2).阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键名合,由于阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.(3).苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,

3、而DNA溶于水相.离心分层后取出水层,屡次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNAo此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出.此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中参加固体氯化钠调节至2.6M.参加2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%?80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中枯燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改进,在提取过

4、程中参加SDS.NaCVCTAB法,我一直,比拟好用,至少做PCR时没有问题.试剂的配制?Tris?Cl(1M,100ml):12.11gTris碱溶于80mlddH2O中,力口4.2ml浓盐酸,调pH至8.0.最后定容到100ml.?EDTA(0.5M,100ml):18.61gNa2EDTA?2H2O溶解在700mlddH2O中,用10MNaOH调pH至8.0,定容至100ml.?TE缓冲液(pH8.0):10mMTris?Cl(pH8.0)、1mMEDTA(pH8.0).在98.8mlddH2O中参加1mlTris?Cl(1M,pH8.0),0.2mlEDTA(0.5MpH8.0).?H

5、Cl(1M):91.38mlddH2O中力口入8.62ml浓盐酸.?NaOH(10M)?10%SDS10gSDS溶在60ml水中,加热搅拌助溶.定容至100ml.?NaCl(5M)?CTAB/NaCl80mlH2O中溶解4.1gNaCl,缓慢参加CTAB10g,加热搅拌,定容至100ml.?酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)?氯仿：异戊醇(24:1)?70%乙醇步骤：1:5ml细菌培养至饱和状态,取1.5ml培养物离心2min；2:沉淀物参加567ulTE反复吹打.力口30ul1%SDS和3l20mg/ml的proteinaseK,混匀,37c水浴1h;3:力口100ul5MNaCl混匀,再参

6、加80lCTAB/NaCl混匀.65c水浴10min；4:参加等体积(720口的氯仿/异戊醇,混匀,离心4-5min,上清液转入一新管；5:参加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5min,上清液转移至一新管；6:参加0.6体积的异丙醇,轻混,沉淀DNA30min,13000rpm15min,弃上清；7:参加1ml70%乙醇洗涤DNA;8:离心5min,弃上清,枯燥,溶于40lTEK细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌,如E.coli,一般有三种可以选择的方法.一、水煮模板法一一主要用于PCR反响1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养1824小时.2、刮取12接种环菌苔参加150

7、微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟.3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,20摄氏度保存备用.操作最简便,对试剂条件要求低.缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质.但是作为一般检测目的的PCR反响模板已经足够了.有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段.编者建议：此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次.二、CTAB/NaCl法1、接种一单菌落于5mlLB中,30C培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100m12%LB中,37C、220r/min培养16小时；3、5000r/min离心10分钟,弃去上清.

8、4、参加10m1TE离心洗涤后,用10m1TE溶解菌体,混匀,-20C保存备用.5、取3.5ml菌悬液,参加184心l10%SDS,混匀,参加37心l10mg/ml蛋白酶K,混匀,37C温育1小时6、参加740心l5mol/LNaCl,再参加512心lCTAB/NaCl,混匀,65C温育10分钟.7、参加等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保存上清.8、上清中参加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24：1),混匀,10000r/min离心5分钟,保存上清.9、参加0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀.10、

9、用1mlTE溶解DNA,参加终浓度为20心g/mlRNaseA,4c保存.CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20gg/mlRnaseA加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染.每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southernblot.编者建议：长时间保存DNA可放于-20C,但要尽量减少反复冻融,否那么影响DNA质量.三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm30s3、200ul裂解液(同CTAB/NaCl法),37c,1hr4、66ul5MNaCL,混匀充分,12000rpm10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀,12000rpm3min,反复抽提至无蛋白层7、取水层,等体积氯仿混匀,12000rpm3min8、上清至新管,2倍体积预冷无水乙醇9、-20C,20min,14000rpm,15min10、400ul70%冷乙醇洗涤11、枯燥,100ul20ug/mlRNaseA,37C,30min12、2倍体积无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗涤13、枯燥,溶于100ulTE介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所