瓜类作物单倍体育种研究进展

1、瓜类作物单倍体育种研究进展李建欣 庞淑敏 方贯娜（郑州市蔬菜研究所 郑州 450015）摘要：综述了瓜类作物单倍体育种的研究进展，包括花药培养、未授粉子房培养和辐射花粉诱导单倍体培养在瓜类作物育种中的应用；总结了近年来所采用的瓜类作物染色体倍性鉴定方法和加倍技术；讨论了目前这些领域存在的问题和今后研究的方向。关键词：瓜类；单倍体；诱导；育种Research advances of haploid breeding of cucurbit cropsLi Jian-xin,Pang Shu-min,Fang Guan-na(Zhengzhou Vegetable Research Institu

2、te,Zhengzhou,450015,China)Abstract: Research advances of haploid breeding of cucurbit crops were reviewed in the paper,including anther culture,ovary culture and induction of haploid obtained by irradiated pollen.Progress of method of ploidy determination and technique of chromosome doubling in cucu

3、rbit crops were summarized.Problems and new points to be probed in these areas were proposed.Key Words:cucurbit crop;haploid;induction;breeding随着植物组织、器官和细胞培养技术的不断深入与发展，单倍体材料以其独特的优势在作物育种中得到了广泛的关注与应用。在瓜类作物中，自发产生单倍体的频率极低1，为了获得单倍体，研究者尝试了花药培养、未授粉子房离体培养，辐射花粉诱导的孤雌生殖等手段诱导单倍体。目前据报道南瓜属、葫芦属、西瓜属和苦瓜属等5个属中均已获得了单倍

4、体，有的已开始在育种中加以利用2。1 花药培养花药培养是以花药为外植体，在单核期诱导小孢子分裂形成胚状体或胚性愈伤组织，然后诱导芽并进一步产生单倍体植株。Dryanovska和Ilieva3从甜瓜花药培养产生了单倍体植株；在国内，薛光荣和陶正南4,5分别报道了成功获得西瓜和甜瓜花粉植株的研究。但由于诱导率低，未能有效用于西瓜和甜瓜的育种中。总的来讲，瓜类作物通过花药培养诱导单倍体难度较大，只有西瓜的花药培养较为成功。Xue等6于1981年利用琼酥西瓜品种，通过培养单核靠边期的花药在国际上首次获得了西瓜单倍体植株，并从其加倍后代中选育出了优良新品种。袁万良等7通过研究解决了愈伤组织褐变死亡的问题

5、，将分化阶段愈伤组织的诱导率从0.5提高到94.4。魏英8在4和10的低温条件下进行预处理，降低了花药壁愈伤组织的形成，提高了花药愈伤组织的诱导率。在南瓜花药培养上，直到1998年，Metwally等9才成功得到了10棵单倍体植株，并对培养基进行了筛选，发现单核中期和单核晚期的南瓜小孢子接种在MS15的蔗糖5 mg·L-1 2,4-D上培养效果较好，每块愈伤组织植株再生频率可达19.2。在甜瓜的花药培养上，Dryanovska等3曾做过尝试，结果以失败告终。最早报道黄瓜花药培养的是日本的西贞夫，他指出黄瓜花药愈伤组织形成率对生长素的反应是敏锐的，其增殖也远比其他蔬菜迅速，但将其白中微

6、带黄色的愈伤组织移植到分化培养基上仅见畸形茎叶的分化，却最终不能育成成体植株10。Lazarte等11(1982)对黄瓜花药进行培养表明，深绿色的愈伤组织常常分化为胚状体及分生组织，胚状体可进一步发育为幼苗。Ashok等12(2003)通过花药培养方法获得了单倍体植株，探讨了预处理、生长因子对黄瓜花药培养的影响，认为4预处理2d的黄瓜花药愈伤组织诱导率及胚胎诱导率最高。通过对生长因子的研究结果表明，生长素中2,4-D比其它生长素效果更佳，最佳浓度为2.0M；细胞分裂素BA优于KN、TDZ，且诱导培养基中低浓度的细胞分裂素有利于启动雄核发育；同时ABA可促进子叶型胚的正常生长并发育成完整植株，对

7、细胞胚性的保持具有较好的作用。此外黄瓜花药可以通过直接胚状体和愈伤组织途径获得单倍体植株12，且花药培养受基因型的影响。Kunmar等13(2004)对黄瓜花药培养的碳源及氨基酸的研究表明花药诱导培养的最佳碳源为蔗糖，浓度0.25M；混合氨基酸 (谷胱氨酸，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸) 在一定浓度范围内的效果比单一氨基酸的效果更好，这说明黄瓜花药培养需要较为充足的营养环境。2 子房培养瓜类作物通过花药培养途径诱导单倍体较困难，鉴于大孢子也是单倍性的，研究者又尝试用雌核发育途径来诱导单倍体，并取得了一定的成功。雌核发育主要包括离体条件下的雌核发育和活体条件下的雌核发育两个方面。在瓜类作物

8、中，主要通过未授粉子房和辐射花粉授粉后的子房进行离体培养两种途径。2.1未授粉子房离体培养通过未授粉子房或胚珠离体培养诱导单倍体在黄瓜、甜瓜、南瓜属上均已见成功的报道。Gémesné等14对黄瓜未授粉子房培养的条件进行过很多探索。1997年，他们取0.51.0 cm长的黄瓜子房通过离体培养首次在黄瓜上获得的了单倍体植株，由于诱导条件和取材大小的原因，诱导频率很低。2002年，他们15对6种不同基因型的黄瓜进行了取材时期和预处理方式的研究，发现雌花开放前6 h时胚囊刚好形成，胚的诱导频率最高，同时发现热处理可以提高最适发育阶段雌配子的雌核发育频率。他们采用的黄瓜胚状体诱导培养

9、基为CBM附加不同浓度的TDZ（0.02-0.10 mg·L-1），适宜的蔗糖浓度为40 g·L-1。杜胜利等16,17研究了黄瓜离体雌核发育时的解剖特征和培养早期外植体的生理生化变化，结果表明，在子房培养的前6 d，外植体的各种酶都发生了与对照明显不同的变化，解剖学观察发现此时雌核发育既已开始。培养24 d 胚状体开始形成，40 d形成成熟的胚状体。在南瓜属中， Metwall等18和陈学军等19利用未授粉胚珠培养，Gémesné等14利用未授粉子房培养均成功的获得了单倍体植株。同时Metwall等18对4低温预处理效果进行了研究，发现植株再生频率在未

10、经过低温处理时最好。甜瓜子房培养的报道相对较少。Gémesné等14曾对培养条件进行过摸索，并得到了单倍体植株。Ficcadenti等20采用了与Gémesné等14相似的培养方法获得了甜瓜的单倍体植株，最高胚发生频率可达36.4，再生植株中单倍体发生频率为15.4。2.2 辐射花粉授粉诱导单倍体研究Sauton等21通过辐射花粉授粉结合胚胎拯救技术从甜瓜作物中成功地获得了单倍体植株，随后人们对基因型、辐射剂量等影响因素进行了系统的研究并将其应用于其他瓜类作物，取得了很大成功。2.2.1 培养基在黄瓜和甜瓜作物单倍体育种中的胚拯救技术一般将辐射花粉授粉后

11、23周的果实剖开，把种子接种到不添加任何激素的MS培养基上进行培养，约10 d后将肉眼可见的绿胚种子挑出，剥出绿胚接种在MS+6-BA 0.2 mg·L-1培养基上生长22,23。在以上培养基上雷春22等的研究报道黄瓜单倍体产率最高可达2.7，而张永兵23等研究报道的厚皮甜瓜4810和薄皮甜瓜新富玉单倍体植株的诱导频率分别为055和063。谢淼24等胚拯救的诱导培养基采用E20A+IAA 0.01 mg·L-1，芽伸长培养基为MS+6-BA 0.05 mg·L-1，生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg·L-1+1.0 g·L-1活性炭

12、，其单倍体再生率最高为128。2.2.2 基因型的影响 基因型对单倍体产生的影响因作物不同有些差异。Ficcadenti等25对甜瓜进行研究发现，不同的正反交组合对单倍体的诱导有显著影响。Faris等26。 用8种不同基因型的黄瓜进行试验也证明，同一剂量下的单倍体发生频率同基因型无关。2.2.3 辐射剂量对单倍体诱导的影响Co60产生的 射线是辐射花粉授粉技术诱导瓜类作物单倍体的有效辐射源。辐射剂量的选择是诱导单倍体的关键因素之一。实践中大多以临界剂量或半致死剂量作为适宜剂量的标准。辐射剂量与作物的种类、辐射的器官和植株的生长状态等有关。黄瓜选用的剂量以200300 Gy辐射时单倍体的诱导率较

13、高27。西瓜的常用剂量也为200300Gy24,25；甜瓜的辐射剂量较常用的是5002500 Gy21；南瓜的有效辐射剂量普遍较低，通常为255O Gy。2.2.4 其他因素的影响亲本植株良好的生长状态直接影响到单倍体的发生频率，因此植株生长在适宜的温湿环境很重要。花粉管到达胚囊的数量越多，越能有效地促进雌核发育21，从而提高单倍体的诱导率，因此辐射授粉前后花粉活力的保持和授粉量的多少也是影响诱导率的关键因素。此外，辐射花粉诱导雌核发生产生的胚大都不能发育完全，败育胚的比例很高，可能与发育不全的胚乳营养供应不足有关 ，因此适时进行胚拯救也非常重要。3 瓜类作物单倍体植株加倍技术研究在瓜类作物单

14、倍体育种中的单倍体自然加倍率很低，仅在西瓜上有过报道6，人为加倍技术一般借鉴传统的西瓜、甜瓜整体诱导多倍体的方法秋水仙碱浸泡法来处理单倍体植株，并无多大改进，因此存在诱导频率低、诱变植株发育不良、花期延迟、部分植株为嵌和体等缺点，离实际应用还有一定的距离。目前，关于瓜类单倍体加倍的深入研究较少，并且仅局限在单倍体植株的离体加倍处理。K.Abak等29，对黄瓜单倍体植株进行离体加倍试验，具体作法是：取一个月左右的无菌苗在无菌状态下用秋水仙碱浸泡后，用无菌水冲净，转入E20A培养基培养，被驯化后的小苗转入蛭石中育苗，结果以0.5秋水仙碱处理4h或1秋水仙碱处理2h两个处理对黄瓜单倍体加倍均有效，但

15、诱导成活率较低，仅为6左右。N.Sari和K.Abak等30，采用0.5秋水仙碱和以上方法也成功地使西瓜单倍体加倍得到双单倍体植株，而用1秋水仙碱浸泡西瓜单倍体幼苗生长点24h，却未获得双单倍体植株。因此他们认为，与甜瓜相比，西瓜对秋水仙碱的敏感程度较低。在加倍得到的西瓜双单倍体植株有正常的叶片大小、生长势和育性，自交能获得种子。4 单倍体植株的倍性鉴定4.1 染色体记数法 染色体计数法,是确定倍性最基本和最精确的方法,通常以根尖为材料,也可选择以卷须、叶片愈伤组织为材料,常采用压片法和去壁低渗法进行染色体标本制备,其中后者是当前植物染色体研究中的重要方法,该方法既可用于染色体计数,还可用于染

16、色体组型分析Gimsa分带等研究,并可借助扫描电镜对植物染色体进行观察。4.2 形态鉴定法N.Sari等30研究比较了两个西瓜品种二倍体及其单倍体植株的田间表现，发现单倍体植株的叶面积、茎长、茎粗显著低于二倍体，单倍体植株的雌、雄花也明显小于二倍体，单倍体雄花中没有花粉粒，而二倍体则有。韩毅科、杜胜利等31在进行黄瓜单倍体鉴定时发现黄瓜单倍体一般叶片较小，植株长势较弱，单倍体不能正常结子，雄花败育，其中单倍体雌雄花花冠明显深裂，可作为区分黄瓜单倍体和二倍体植株的明显形态标志。4.3 细胞学鉴定法若进行单倍体诱导、加倍研究，根据植株形态鉴定其倍性，时间较晚，因此必须借助细胞学手段进行培养期的倍性

17、鉴定。目前，染色体计数法是倍性鉴定最准确、直接的鉴定方法，但染色体制片需要较高的细胞学水平，且费时、费力。N.Sari等30在西瓜上、Norio Katon等32马国斌等33在甜瓜上发现叶片保卫细胞叶绿体个数与植株倍性呈正相关，可作为鉴定西、甜瓜植株倍性的快速、有效的方法，而在黄瓜上也存在这种相关性。N.Sari等30、张兴平等34在西瓜上利用流式细胞仪（flow cytometry）测定细胞核内DNA的含量，可迅速确定细胞的倍性并进一步鉴定植株的倍性。5 存在问题及展望目前瓜类作物单倍体育种中的子房培养、胚抢救和花药培养等均已获得成功，并取得了可喜的进展，但仍然存在诱导频率低31，重复性差等

18、问题，因此离建立一套成熟的培养体系还有一定距离。瓜类作物的单倍体培养自然加倍率不高，这些植株必须经过秋水仙碱等处理后才能变为二倍体，有的甚至会产生多倍体，这些都不在研究者的控制范围之内，因此单倍体加倍方法有待继续探讨。单倍体育种中是否出现理想的重组体是关键，后代株系间的分离类型、出现频率、变异幅度是育种者关心的问题，现在还没有人对瓜类单倍体培养的后代变异进行研究。自交系选育是现代杂交优势育种的关键，传统的 F1经多代自交、回交一般需要5-6年或更长时间才能纯合，而用单倍体诱导及加倍技术仅需 5-6 个月，便可从优良品种 F1 中获得优良纯系，加速自交系的选育，获得新的育种材料，缩短育种年限，从

19、而提高瓜类作物新品种的选育速度。此外，离体培养直接得到纯合株，有利和不利的隐性突变基因都可以得到表达，进行离体诱变和抗性突变体筛选，可使选择效率大大提高。总之，随着瓜类单倍体技术的深入研究和应用，对其在育种材料的创新、新品种的培育，将发挥更重要的作用，促进瓜类生产的发展。参考文献1 Savin F ，Decomble V ，Le Couviour M ，et .al. The X-ray dtection of haploid embryos arisen in muskmelon Cucumis melo L.seeds，and resulting from a parthenogeneti

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