细胞培养用于GM

1、细胞培养用于gm mo7e细胞系对gm-csf具有高度生长依靠，且呈剂量依靠关系。mo7e对il-1,il-4,il-5,il-6,tnf刺激不敏感。可采纳3h-tdr掺入法举行活性检测。 【材料】 1细胞株源于人急性原巨核细胞白血病的mo7e细胞系。 2. mo7e维持培养液为dmem，含10% fcs,10ng/ml rgm-cfs和0.5 ng/ml il-3。 【办法】 测试时培养液不含任何生长因子。mo7e细胞先在dmem-fcs培养液中培养3天，用dmem洗涤二次后，再悬于dmem-fcs中，浓度为2x105/ml。于96孔微量培养板每孔加入2x104个mo7e细胞和经倍比稀释的样

2、品或标准品gm-csf，另每个样品孔加抗il-3单抗。标准品孔加等体积的培养液。各个稀释度设3个复孔。对比加mo7e细胞和培养液。37，5% c02孵育72小时，然后每孔加入18.5kbq 3h-tdr，再孵育4小时。多头细胞收集器收集细胞于滤纸上，烤干后举行液闪计数。 【结果】 参照标准gm-csf量效曲线，便可得出样本gm-csf活性。 【注重事项】 实验中应加入抗il-3抗体排解干扰。 以上细胞因子检测办法都是从蛋白水平对细胞因子举行测定，而分子生物学办法则是从基因水平，检测其mrna的表达状况，近年来，分子生物学的检测技术进展快速，因为几乎全部公认的细胞因子的基因均已被克隆化，因此可利

3、用基因探针检测这些细胞因子mrna的表达，其办法多种多样，如斑点杂交、northern转印、细胞组织原位杂交和rt-pcr等。尤其是定量pcr的浮现使细胞因子mrna的定量分析成为可能。 细胞培养用于ifn的活性检测 【原理】 与型干扰素均具有抗病毒活性，当未加ifn的对比孔75100细胞浮现病变，而未加病毒的细胞对比依旧完好时，此时若与某一稀释度的ifn标本共育的细胞仍有50%左右不浮现病变，则表示该样品内含有庇护细胞的足量ifn，其稀释度即为标本中含有的ifn效价。但因为各试验室所用细胞和病毒种类不同，测定条件各异，所得活性单位（u)会有很大不同。故必需经国际参考品校正后得出统一的单位，即

4、用国际单位（iu）表示。 【材料】 1细胞 测人ifn用a549细胞或hep-2细胞，测鼠ifn时用l929细胞。细胞浓度4x105/ml。 2病毒 水疱口炎病毒（vsv) 5x107 pfu/ml。 3培养基 mem-eagle培养液+10、10u/ml与10o ug/ml。 4染色液 0.2结晶紫（结晶紫2g、50ml,95500ml, nacl8g加蒸馏水至1l，用滤纸过滤）。脱色液：加等量蒸馏水配制。 5. ifn标准品、标定为50001u/ml。 6.96孔微量培养板、微量移液器（40200ul）、微量振荡器、倒置显微镜、酶标比色仪、胶带等。 【办法】 1于96孔培养板上加培养基10

5、0微升孔，在a,b两排第1孔内加1:10 ifn标准品稀释液100ul，在c,d两排第1孔内加待测样品各100ul，用移液器将各排作倍比稀释，即于第1孔内反复吹吸5次混匀，吸出100ul加到第2孔内混匀，并依次向下移入100ul作倍比稀释至第9孔，最后吸弃100ul。每排作稀释时均换一个移液吸头。a,b两排第10孔作病毒对比，c,d两排第10孔作细胞对比。 2倍比稀释后，向各孔内加入100ul细胞悬液（4x105/ml)，加盖静置1020分钟，待细胞自然匀称沉降后置37,5% co2孵箱中培养。 3培养6小时后用倒置显微镜观看，若成单层细胞即可攻毒，向各孔加入一定浓度的vsv100ul（用法浓

6、度以24小时浮现cpe为适度。若检测，-ifn时需24小时后再攻毒）。细胞对比孔加培养液100ul。1824小时后待病毒对比孔细胞几乎达100% cpe时，可倾去培养液，各孔加染色液染色40小时，染毕用水洗板，空气晾干。此时普通用肉眼即可估量出效价。 4挺直用酶标比色仪举行检测。（普通不需脱色，但当细胞分布不均一时，可于比色前先加200ul脱色液，脱色20分钟）比色波长用550nm，最后按照光密度（od）值计算出样品中ifn的活性单位。计算办法是先算出50细胞病变时的od值，即（细胞对比孔od550+病毒对比孔od550)÷2，再将样品在两对比值之间的各od550及其稀释度的对数分离输入计算器，并按指数回来方程（y=a·ebx）按键，求出