紫外可见光谱分析技术

1、紫外可见光谱分析技术及其发展和应用医学院 宋宗辉 2016201632 紫外-可见吸收光谱法概述分子的紫外-可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。紫外光谱的研究对象大多是具有共轭双键结构的分子。紫外-可见以及近红外光谱区域的详细划分如下图所示。紫外-可见光区一般用波长（nm）表示。其研究对象大多在200-380 nm的近紫外光区和/或380-780 nm的可见光区有吸收。紫外-可见吸收测定的灵敏度取决于产生光吸收分子的摩尔吸光系数。该法仪器设备简单,应用十分广泛。如医院的常规化验中，95%的定量分析都用紫外

2、-可见分光光度法。在化学研究中，如平衡常数的测定、求算主-客体结合常数等都离不开紫外-可见吸收光谱。紫外可见区域1.1分子结构与吸收光谱1.1电子能级和跃迁从化学键性质考虑，与有机物分子紫外-可见吸收光谱有关的电子是：形成单键的电子，形成双键的电子以及未共享的或称为非键的n电子。有机物分子内各种电子的能级高低次序下图所示，*>*>n>>。标有*者为反键电子。电子能级及电子跃迁示意图可见，*跃迁所需能量最大，max<170 nm，位于远紫外区或真空紫外区。一般紫外-可见分光光度计不能用来研究远紫外吸收光谱。如甲烷，max =125 nm。饱和有机化合物的电子跃迁在远

3、紫外区。1.2生色团*所需能量较少，并且随双键共轭程度增加，所需能量降低。若两个以上的双键被单键隔开，则所呈现的吸收是所有双键吸收的叠加；若双键共轭，则吸收大大增强，波长红移，max和max均增加。如单个双键，一般max为150-200nm，乙烯的max = 185nm；而共轭双键如丁二烯max = 217nm，己三烯max = 258nm。 n*所需能量最低，在近紫外区，有时在可见区。但*跃迁几率大，是强吸收带；而n*跃迁几率小，是弱吸收带，一般max<500。许多化合物既有电子又有n电子，在外来辐射作用下，既有*又有n*跃迁。如-COOR基团，*跃迁max=165 nm，max=40

4、00；而n*跃迁max=205nm，max=50。*和n*跃迁都要求有机化合物分子中含有不饱和基团，以提供轨道。含有键的不饱和基团引入饱和化合物中，使饱和化合物的最大吸收波长移入紫外-可见区。这类能产生紫外-可见吸收的官能团，如一个或几个不饱和键，C=C,C=O,N=N,N=O等称为生色团（chromophore）。某些生色团的吸收特性见下表。某些生色团及相应化合物的吸收特性有些基团本身在200 nm以上不产生吸收，但这些基团的存在能增强生色团的生色能力（改变分子的吸收位置和增加吸收强度），这类基团称为助色团(auxochrome)。一般助色团为具有孤对电子的基团，如-OH, -NH2, -S

5、H等。 含有生色团或生色团与助色团的分子在紫外光区有吸收并伴随分子本身电子能级的跃迁，不同官能团吸收不同波长的光。作波长扫描，记录吸光度对波长的变化曲线，就得到该物质的紫外-可见吸收光谱。 1.2 其他生色的物质：某些无机金属离子也会产生紫外-可见吸收。如含d电子的过渡金属离子会产生配位体场吸收带。依据配位场理论，无配位场存在时，能量简并；当过渡金属离子处于配位体形成的负电场中时，5个简并的d轨道会分裂成能量不同的轨道。不同配位体场，如八面体场、四面体场、正方平面配位场等使能级分裂不等。金属离子一定时,分裂能级差DE=10Dq的值依下列顺序增大： ；配位体一定时，DE=10Dq的值的增大顺序为

6、M2+<M3+<M4+，3d<4d<5d。在外来辐射激发下，d电子从能量低的轨道跃迁到能量高的轨道时产生配位体场吸收带。一般配位体场吸收带在可见区，emax约0.1-100 l/molcm，吸收很弱。因此配位体场吸收带对定量分析用处不大。 镧系及锕系离子5f电子跃迁产生的f电子跃迁吸收谱带出现在紫外-可见区。由于f轨道为外层轨道所屏蔽，受溶剂性质或配位体的影响很小，故谱带窄。 少数无机阴离子，如NO3-(lmax=313 nm)、CO32-(lmax =217 nm)、NO2-(lmax =360 、280 nm)、N3-(lmax =230 nm)、CS32-(lma

7、x =500 nm)等也有紫外-可见吸收。2 影响紫外-可见吸收光谱的因素2.1各种因素对吸收谱带的影响：表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带精细结构的出现或消失等。 谱带位移包括蓝移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)和红移(bathochromic shift or red shift)。蓝移（或紫移）指吸收峰向短波长移动，红移指吸收峰向长波长移动。吸收峰强度变化包括增色效应(hyperchromic effect)和减色效应(hypochromic effect)。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。各种因素对吸收谱带的影响结果如下图所示。蓝移

8、、红移、增色、减色示意图2.2取代基的影响在光的作用下，有机化合物都有发生极化的趋向，既能转变为激发态。当共轭双键的两端有容易使电子流动的基团(给电子基或吸电子基)时，极化现象显著增加。给电子基为带有未共用电子对的原子的基团。如-NH2, -OH等。未共用电子对的流动性很大，能够和共轭体系中的p电子相互作用引起永久性的电荷转移，形成p-p共轭，降低了能量，lmax红移。吸电子基是指易吸引电子而使电子容易流动的基团。如： 等。共轭体系中引入吸电子基团，也产生p电子的永久性转移，lmax红移。p电子流动性增加，吸收光子的吸收分数增加，吸收强度增加。给电子基与吸电子基同时存在时，产生分子内电荷转移吸

9、收，lmax红移，emax增加。给电子基的给电子能力顺序为：-N(C2H5)2>-N(CH3)2>-NH2>-OH>-OCH3>-NHCOCH3>-OCOCH3>-CH2CH2COOH>-H吸电子基的作用强度顺序是：-N+(CH3)3>-NO2>-SO3H>-COH>-COO->-COOH>-COOCH3>-Cl>-Br>-I2.3 溶剂的影响一般溶剂极性增大，pp*跃迁吸收带红移,np*跃迁吸收带蓝移。分子吸光后，成键轨道上的电子会跃迁至反键轨道形成激发态。一般情况下分子的激发态极性大于基态

10、。溶剂极性越大，分子与溶剂的静电作用越强，使激发态稳定,能量降低。即p*轨道能量降低大于p轨道能量降低，因此波长红移。而产生np*跃迁的n电子由于与极性溶剂形成氢键，基态n轨道能量降低大，np*跃迁能量增大，吸收带蓝移。2.4 质子性溶剂的影响质子性溶剂容易与吸光分子形成氢键。当生色团为质子受体时吸收峰蓝移，生色团为质子给体时吸收峰红移。如下所示的化合物存在两种平衡态，为质子受体，其在甲醇中的吸收波长最短，溶液呈黄色。3 吸收定律摩尔吸收系数表示吸光物质对指定频率光子的吸收本领，因此由可以估计分光光度法所能达到的理论灵敏度。只有当光子在近似分子大小范围内与吸光分子碰撞时，才能产生吸收。分子截面

11、积越大，碰撞的几率越大。光束强度越大，总光子数越多，吸收跃迁几率越大，产生的吸收越大。因此， 式中，为阿伏伽德罗常数；为吸收跃迁几率，如果每次碰撞对光吸收都有效， ；是吸光分子的截面积，约为；是光束强度；代表分子随机取向的统计因子；表示吸收层厚度。3.1 吸收定律的适用性吸收定律俗称比尔定律，其成立条件是待测物为均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射；入射光为单色平行光。 a比尔定律在有化学因素影响时不成立。b解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离。c比尔定律在有仪器因素影响时也不成立。d非单色光对比尔定律产生偏离。e杂散光(非吸收光)也会对比尔定律产生影响。f其他

12、影响因素包括溶剂、光效应等也应考虑。 4 紫外可见光谱技术的发展4.1紫外吸收检测器的发展紫外吸收检测器又分二维检测器和三维检测器。三维检测器有扫描型和二极管阵列式。4.1.1紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。用UV-VIS检测时，为了

13、得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。4.1.2紫外检测器是二维检测器，选择一个特定的波长检测,一般用于已有文献和已知样品最大吸收波长的定量检测;而二级管阵列可以在200-800nm选择一个波长范围检测,可以用于不知道样品最大吸收波长的情况下,选择一个波长进行定量,也可以通过观察紫外光谱,可以做到一定程度上的定性。一般用于紫外分光光度计。紫外检测器是在同一时间测量一个波长下的数据，而二极管阵列是在同一时间分别测量N个波长下的数据。由于要同时测量N点数据，所以

14、要用损失精度来换取，也就是说，紫外检测器的检测精度要远高于二极管阵列，但二极管阵列可以在同一时间给出不同波长的谱图，也就是三维谱图。4.1.3二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）：以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器.它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的

15、光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。二极管阵列检测器可以获得全波长的样品信息，而且可以根据吸收光谱辅助定性。但相对来说，专门的紫外检测器灵敏度能高一些。5 紫外可见光谱技术的应用5.1 定性分析5.1.1判断异构体：紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。 如：和前者有紫外吸收，后者的lmax<200nm。同样，CH3COCH2CH2COCH3的最大吸收波长要短于CH3CH2CO-COCH2CH3。下面两个酮式和烯醇式异构体中，烯醇式结构的摩尔吸光系数要远大于酮式，也是由于烯醇式结构中有双键共轭之故。CH2COCH

16、2COOC2H5 CH3C(OH)=CHCOOC2H5酮式(lmax =275 nm, e =100) 烯醇式(lmax =245 nm, e =18,000)5.1.2判断共轭状态：可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯（ph-CH=CH-ph）顺式比反式不易共平面，因此反式结构的最大吸收波长及摩尔吸光系数要大于顺式。顺式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,0005.1.3已知化合物的验证：与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。5.2定量分析紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最

17、广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是：a可用于无机及有机体系。b一般可检测10-4-10-5 mol/l的微量组分，通过某些特殊方法(如胶束增溶)可检测 10-6-10-7 mol/l的组分。c准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。5.2.1分析条件的选择5.2.1.1溶剂的选择所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长。常见溶剂可用于测定的最短波长可用于测定的最短波长(nm)常见溶剂200蒸馏水，乙腈，环己烷220甲醇，乙醇，异丙醇，醚

18、250二氧六环，氯仿，醋酸270N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸乙酯，四氯化碳 (275)290苯，甲苯，二甲苯335丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳(380) 5.2.1.2测定浓度的选择溶液吸光度值在0.2-0.8范围内误差小(A=0.434时误差最小)，因此可根据样品的摩尔吸光系数确定最佳浓度。 5.2.1.3测定波长的选择 一般选择最大吸收波长以获得高的灵敏度及测定精度。但所选择的测定波长下其他组分不应有吸收，否则需选择其他吸收峰。5.2.2定量分析方法 5.2.2.1标准曲线法配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内

19、应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。标准曲线法示意图 5.2.2.2标准加入法样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0, C1, C2, Cn的待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。若直线通过原点，则样品中不含待测组分；若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。标准加入法示意图5.3 常见紫外可见光谱法的仪器5.3.1紫外分光光度计是利用物质对光的选择吸收现象，进行物质的

20、定性和定量分析的光电式分析仪器，也是一种光谱仪器。根据电磁辐射原理，不同的物质具有不同的选择吸收，也即具有不同的吸收光谱。通过对吸收光谱的分析可方便的判断物质的内部结构和化学组成。随着工业生产和科学技术的不断发展，以及人们对物质认识的不断深化，迫切要求发展新的先进的分析技术和仪器，分光光度计就是在这种历史条件下问世和发展的。 分光光度计是分光仪器和光度计的一种组合。按工作光谱原理的不同，分光光度计可分为研究物质分子吸收光谱的分光光度计、研究物质中原子吸收的原子吸收分光光度计、研究物质分子荧光发射的荧光分光光度计和研究物质原子荧光发射的原子荧光分光光度汁、研究分子喇曼散射光谱的喇曼光谱仪等。由于

21、分光光度法具有分析精度高、测量范围广、分析速度快、样品用量少等优点，分光光度计已成为探索自然、改造自然、发展科学技术和生产的强有力的工具，是现代化分析实验室必备的常规仪器之一。5.3.2分光光度计的基本组成a、光源光源指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。实际上许多光源的强度都随波长变化而变化。为了解决这一问题，在分光光度计内装有光强度补偿装置，使不同波长下的光强度达到一致医学教育网搜集整理。可见光分光光度计常用光源是钨灯，能发射出350nm2500nm波长范围的连续光谱，适用范围是360nm1000nm.现在常用光源是卤钨灯，其特点是发光效率大大提高，灯的使用寿命也大大延长。紫外光光度计常用氢灯作为