猪主动脉内皮细胞培养

1、猪主动脉内皮细胞培养 血管内皮细胞（vascular endothelial cell)是衬于心血管和毛细血管的腔面的一层扁平上皮细胞，呈多边形，边缘成锯齿状，互相嵌合而连续。血管内皮细胞的培养因取材、消化等办法不同可分为灌注消化法、消化刮取法、组织块消化法等，细胞贴壁生长后可举行传代培养。体外培养猪主动脉内皮细胞常用分别细胞培养法，自乳猪猎取主动脉，以混合消化液消化血管内皮、培养动脉内皮细胞，并可稳定传代10代左右。此法也适用于牛、兔、鼠等动物大血管的内皮细胞培养。 【材料】 1组织来源幼猪（体重810kg）的胸、腹主动脉。 2培养液 m199或dmem彻低培养液（含20、2mmol/l、1

2、 mmol/l、3.5g/l、100 u/ml、100ug/ml,ph 7.2)。 3其他用液混合消化液（0.125%胰蛋白酶-0.01 % edta，容积比为1.1)；不含ca2+和mg2+的hanks液（cmf-hanks液）,10万iu/l、100mg/l，或。 4培养器具培养瓶（或皿），白内障手术刀、眼科剪、镊子、静脉留置插管、注射器，解剖显微镜，倒置显微镜等。 【办法】 1灌注消化法 (1)取材：按动物体重用（25mg/kg）麻醉动物，颈动脉放血将幼猪处死。剪（剃）掉颈部或腹股沟区的毛，用75消毒手术区，手术取颈总动脉或股动脉，长约1015cm，放入盛有预冷cmf-hanks液的无菌

3、平皿内，带入超净工作台内。 (2）血管处理：用cmf-hanks液洗净血管，并在解剖显微镜的协助下用眼科剪、镊将血管的外膜结缔组织剥除，并洗净血管腔内的血液。 (3）消化血管内皮细胞：将血管放入培养皿中，用cmf-hanks液冲洗3次。从动脉一端插入静脉留置导管并结扎固定，然后用丝线结扎血管的另一端。通过静脉留置导管向血管内注入混合消化液，其量以血管充盈为准。在37孵箱内消化1015分钟。 (4)制备细胞：在血管的游离端切口，收集消化液，然后用l0ml培养液冲洗管腔。将消化液和冲洗液离心（1000r/min离心10分钟），吸弃上清液，用含20% fbs的dmem培养液混悬沉淀细胞。将细胞接种在

4、培养皿内，置37 ,5% c02孵箱中培养，每隔23天换液1次，换液时吸去原培养皿内1/22/3的培养液，用新奇培养液补齐原量继续培养。待细胞生长贴壁形成单层时举行传代。 2消化刮取法 (1)于37水浴预热培养用液和消化液； (2）按动物体重以80mg/kg肌注麻醉幼猪，将幼猪颈部及胸、腹正中线部位的毛剃去，用碘酊、乙醇行常规消毒。在无菌条件下，做胸腹联合切口，快速打开胸腔和腹腔，分别并取出胸主动脉和腹主动脉，放入含cmf-hanks液的培养皿中； (3)在超净台上用眼科剪、镊子尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用cmf-hanks液多次冲洗血管外表及血管腔内的凝血，转入另一个盛有cmf-

5、hanks液的培养皿内；纵向剪开血管，反复冲洗整洁血管壁后，在另一个大的无菌培养皿内滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶-0.01 % edta的混合消化液（约23m1)，然后将主动脉内膜面朝下，铺在消化液上。在37条件下，让血管内膜与消化液充分接触并消化1020分钟，再加入少量dmem彻低培养液，以终止消化液的作用； (4)将上述主动脉转移至一个无菌培养平皿内，用白内障刀轻轻将内皮刮下，先纵向（顺血管走向）有次序地刮内膜12次，然后再横向刮12次； (5)用23m1 dmem彻低培养液将内皮细胞收集到离心管内，以转速1000r/min离心710分钟；也可省去离心过程，挺直用l0ml的dmem彻低

6、培养液将刮下的内皮细胞收集到无菌培养瓶内，以细胞计数结果调节细胞密度为（1.52.0)x105/ml的细胞悬液，接种在25cm2培养瓶内，置37,5% co2孵箱内培养； (6)培养24小时后换液，即弃去旧培养液，用新奇培养液轻轻洗1次细胞，重新换上新培养液，继续培养。此后每隔23天换一次液，待细胞长至融合状态以后即可传代； (7)传代时，弃去培养液，用预热的cmf-hanks液清洗2次，加入0.125-0.01% edta的混合消化液，室温下消化12分钟，在倒置显微镜下观看到细胞开头收缩变圆，间隙增宽后，立刻翻转培养瓶，倒掉消化液，用cmf-hanks液轻轻清洗1次，加入dmem彻低培养液，

7、用弯头吸管将消化的贴壁细胞吹打下来，并吹打成匀称的细胞悬液，补齐原培养液量的2倍，按1:2传代接种，置37,5% c02孵箱内培养； (8）天天观看细胞的生长状况，普通隔23天换新奇dmem彻低培养液1次，每次仅换掉2/3的培养液，待细胞贴壁融合后，可再经传代扩增细胞。 【结果】 动脉内皮细胞的原代培养，从动脉内膜上消化下来的细胞接种培养皿，30分钟后开头贴壁，细胞多呈圆形，少数可为多边形，46小时后细胞贴壁率为90左右，12小时后可见细胞生长增殖现象，积累生长呈小簇状；24小时后内皮细胞可形成数量不等的细胞群，大约1周后各细胞向外扩展互相融合形成单层细胞，为典型扁平长多角形细胞，呈卵石状罗列。传代培养的内皮细胞接种10分钟后就可见贴壁，培养23天后，生长快速，细胞较大，有23个显然增大的椭圆形细胞核，细胞铺满后呈典型的铺路石样。 【注重事项】 原代培养的动脉内皮细胞中常有血细胞、纤维细胞和平滑肌细胞的污染。血细胞贴壁能力较弱，可以在培养液内加入肝素并于细胞接种3小时后换液予以清除；消化时，将血