肺癌组织细胞FHIT基因启动子甲基化和转录表达

1、肺癌组织细胞FHIT基因启动子甲基化和转录表达 作者：余宗涛， 袁亚莉， 张吉才， 高琼， 王元元【摘要】 目的探讨FHIT (fragile histidine triad,脆性组氨酸三联体)基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系。方法用实时定量PCR检测FHIT mRNA在肺癌组织、肺癌旁组织与去甲基化剂5氮杂2脱氧胞苷（5Aza2deoxycytidine、5AzaCdR）处理前后A549细胞株中的表达，用甲基化特异性PCR（MSPCR）检测FHIT启动子CpG岛甲基化状态。结果FHIT mRNA在肺癌旁组织中全部表达，在肺癌组织中表达缺失率为48.89%（22/4

2、5），且表达量低于正常肺组织（t=-15.851，<0.001），但在不同年龄和性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类的差异无显著性；FHIT基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为40%(18/45)、在癌旁组织中频率8.7%(2/23)（2 =7.184, <0.01），18份启动子区甲基化的肺癌标本中，10份同时伴有mRNA表达缺失。结论在肺癌组织中，FHIT基因启动子甲基化频率明显升高，其表达缺失或下调，提示FHIT启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。 【关键词】 肺癌；CpG岛甲基化；MSPCR；FHIT基因 1资料与方法 1.1资料 1.1.1标本来

3、源收集湖北省十堰市太和医院2005 年3月2006 年2月手术切除肺癌新鲜标本45例，男28例、女17例。小细胞肺癌（SCLC）8例、非小细胞肺癌（NSCLC）37例。全部标本均经病理证实。连同23例距离肿瘤边缘2cm外正常对照组织。-80冰箱保存备用。 1.1.2A549细胞株培养及药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5% CO2条件下培养24h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5AzaCdR处理，24h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前，连续作用3d后弃去药液，用完全培养液继续培养4d后进行实验

4、，用同体积PBS处理的细胞作为对照组。 1.1.3主要试剂及及仪器Wizard DNA clean up、Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(美国Promega公司)； 5AzaCdR(美国Sigma公司)；人肺癌细胞株A549购自武汉大学生物保藏中心；PE7000(美国ABI公司)。 1.1.4引物合成FHIT甲基化引物4(53 ； 53)，扩增片段长度为74bp；FHIT非甲基化引物4(5TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG3；5CATAAACAACACCAACCCCACTA3)片段长度为74bp； FHITm

5、RNA引物4(5GCTCTTGTGAATAGGAAACC3； 5TCACTGGTTGAAGAATACAGG3)片段长度为532bp；GAPDHmRNA引物5 （5GAAGTTGAAGGTCGGAGTC3； 5GAAGATGGTGATGGGATTTC3）片段长度为226bp（北京赛百盛公司）。 1.2方法 1.2.1组织、细胞DNA提取以经典酚氯仿抽提法提取组织DNA，经紫外260nm定量后于-80保存备用。 1.2.2组织、细胞RNA提取后逆转为cDNA用Trizol操作说明书进行提取组织及细胞RNA，提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转为cDNA备用。 1.2.3基因组

6、DNA的磺化修饰参照文献6，取4g（总体积为50l）基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50l 去离子水中，置-40备用。 1.2.4MSPCR磺化修饰后的基因组DNA 50100ng (3l)，10×buffer 3l，2mmol/L dNTP 3l，25mmol/L氯化镁3l，Taq 酶2U(1l)，上下游引物各2l (12pmol)，20×SYBR Green 0.75l，去离子水补齐至30l。置PE7000仪进行扩增：95变性3min，(95×60s, 58×30s, 72×6

7、0s) ×40，在72读取荧光值，最后一个循环72延伸5min。 1.2.5RTPCR用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100l，PCR反应体系及循环参数同MSPCR。 1.2.6FHITmRNA相对定量方法利用检测得到的Ct值和计算得到的扩增效率，以GAPDH mRNA的量为参照，计算FHIT mRNA的相对量。FHIT mRNA/GAPDH mRNA用下述公式计算：(1+EGAPDH) Ct (GAPDH)/(1+EFHIT) Ct(FHIT)7。 1.2.7统计学分析用SPSS10.0软件分析，mRNA表达水平定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验。 2结果 2.1MSP

8、CR检测结果肺癌基因组DNA标本中，有10例（其中SCLC 3例）只存在甲基化PCR产物，另外35例标本中都存在非甲基化PCR 产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的8例（其中SCLC 1例）；而在23例正常对照组织中，存在甲基化2例，且均可检测出非甲基化产物的存在，两者之间差异有统计学意义，见表1；在年龄、性别、分化程度、肿瘤的病理类型、肿瘤大小差异无统计学意义（P>0.05）。表FHIT甲基化化状况及mRNA相对定量 组织病例注： 检验：2 =7.184、 P<0.01； 两独立样本t检验：t=-15.851、 P<0.0012.2靶基因FHIT

9、mRNA的相对定量癌旁组织中，FHIT mRNA相对定量在0.85±0.11，而在检出甲基化的18例肺癌组织中，10例FHIT mRNA低于检测下限；在肺癌标本中 FHIT mRNA的相对定量在0.24±0.20，差异显著；在A549细胞株中，FHIT mRNA测定比值为0.56，但用5AzaCdR处理后，其FHIT mRNA测定比值为0.97。 2.3PCR产物分析经2%琼脂糖凝胶电泳证实了是一条特异的目的带, 见图13。图1 MSPCR 检测肺癌中FHIT 基因 甲基化状态电泳图M=74bp， U=74bp图2管家基因GAPDH(226bp)内对照电泳图M：甲基化； U

10、：未甲基化； DW：蒸馏水； Blank：空白对照； Marker：分子量标准 图3FHIT mRNA(532bp) RTPCR电泳图3讨论我们实验组用SYBR Green 实时定量PCR测定FHITmRNA在45例肺癌组织中的相对定量，其表达缺失率高达48.89%(22/45)，且即使表达其表达量也显著降低，而在相对应的23例癌旁正常组织中几乎全部正常表达，两者的表达差异显著但与病人的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的病理类型等病理因素不相关。表明FHIT的表达缺失与肺癌的发生有一定的相关性，提示FHIT可能为肺癌的候选抑癌基因。用MSPCR检测肺癌组织FHIT启动子甲基化率，40.00%的病例标

11、本存在FHIT基因启动子区域CpG位点甲基化。而正常对照组织中，存在甲基化的仅有8.70%，两者差异显著。表明在肺癌组织中，FHIT基因启动子区域确实存在CpG位点被甲基化的现象。在18例甲基化阳性的标本中有10例FHIT表达缺失，A549肺癌细胞株检测甲基化阳性，用5AzaCdR处理后FHITmRNA相对定量显著增高，这是由于5AzaCdR去甲基化，使由于启动子甲基化而沉默的FHIT再次表达，说明基因启动子甲基化可以使基因表达缺失或下调。根据已被广泛证实的启动子区域的DNA甲基化胞嘧啶的密度和基因转录活性的相互关系8，基因由于启动子甲基化而失活，不仅抑制基因的表达，还改变蛋白和DNA的相互作

12、用，导致染色质结构的改变，是抑制基因活性的一种重要机制。抑癌基因FHIT由于启动子甲基化而完全或部分失活，失去对细胞异常增殖的抑制调控，促进肺癌的发生。总之，我们通过检测肺癌组织中FHIT基因启动子甲基化及在肺癌细胞株A549上的去甲基化剂5氮杂2脱氧胞苷处理，比较完整地阐述了FHIT基因启动子甲基化导致FHIT基因表达失活机制以及在肺癌发生过程中所发挥的作用。【参考文献】 1Barnes LD,Garrison PN,Siprashvili Z,et al.Fhit, a Putative Tumor Suppressor in Humans, Is a Dinucleoside 5'

13、;,5' ''P1,P3Triphosphate HydrolaseJ. Biochemistry,1996, 35(36)： 1152911535.2Ji L, Fang B, Yen N, et al. Induction of Apoptosis and Inhibition of Tumorigenicity and Tumor Growth by Adenovirus Vectormediated Fragile Histidine Triad (FHIT) Gene overexpressionJ. Cancer Res，1999, 59(14):33333

14、339.3Bird AP. CpGrichisland, and the function of DNA methylationJ. Nature，1986, 321(6067)： 209213. 4Dhillon VS, Shahid M, Husain SA. CpG methylation of the FHIT, FANCF, cyclinD2, BRCA2 and RUNX3 genes in Granulosa cell tumors (GCTs) of ovarian originJ. Mol Cancer， 2004,1（3）:33.5Kanai Y,Ushijima S,Ko

15、ndo Y,et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation of CPG islands and pericentromeric satellite regions in human colorectal and stomach cancersJ. Int J Cancer， 2001, 91(2): 205212.6Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylationspecific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islandsJ. Proc Natl Acad Sci USA， 1996, 93(18):98219826.7陈英剑,胡成