生化复习资料：酵母单杂交技术

1、酵母单杂父技术YeastOne-hybridmethod一、原理酵母单杂交方法是根据 DNA 结合蛋白即转录因子与 DNA 顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因cDNA.该方法也是在细胞内invivo分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法.将的特定顺式作用元件构建到最根本启动子minimalpromoter,Pmin上游,Pmin 启动子下游连接报道基因.进彳 fcDNA融合表达文库筛选时,编码目的转录因子的 cDNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后,其编码产物转录因子与顺式作用元件结合,就可以激活 Pmin 启动子,并促使报道基因表达.根据报道基因的表达

2、,筛选出与顺式元件结合的转录因子.二、实验步骤构建报道子载体：将的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子minimalpromoter,Pmin上游,其下游连有报道基因；将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选适宜的 3-AT 浓度；提取总 RNA,合成 cDNA 双链；将报道子、cDNA 和融合表达载体共转化到酵母中,在相应的缺陷性 SD 培养基上进行筛选阳性克隆；对阳性克隆进行鉴定,去除假阳性克隆；对所获得的阳性克隆进行测序,为进一步分析打下根底.如可进一步分析 DNA 确切的结合位点.三、图片分析1、选择 YM4271pHISi3NF4克隆株重复进行 3-AT 梯度试验,在没有

3、3-AT 的 SD/-His 平板上生长状态很好,在15mM3-AT存在下被明显抑制,而在30mM3-AT存在下完全不能生长.应选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度.仆fnV15mM3nmMfnV15mM3nmM一2、 经 9 天培养,在 SD/-Leu/-His/+15mM3-AT选择培养基上共长出 351 个大小不同的阳性候选克隆.取100 个菌落划线于 30mM3-AT 和 60mM3-AT平板,仅有 1 个克隆被淘汰.证实 15mM3-AT的选择是正确的.挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化 E.coliTop10F后,酶切鉴定,共得到 31 个初筛阳性克隆.门口pqrpqr-

4、-IuIu一科x M M四、严谨性分析1、为了克服 His3 基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响,我们选择克隆株重复进行 3-AT梯度试验.菌株在没有 3-AT 的 SD/-His 平板上生长状态很好,在 15mM3-AT 下被明显抑制,而在 30mM3-AT 下完全不能生长.应选择 15mM 为筛库实验的 3-AT 工作浓度.2、存在假阴性结果.Pull-downsPull-downs的原理、步骤、图片分析、实验严谨性原理：用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白GST-PolyHis-或生物素-,借助蛋白质之间的亲和性,如酶与底物谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶或抗原与抗体Myc 蛋白与其抗体、细菌

5、受体与血清蛋白、多聚组氨酸与金属离子等的亲和性,从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白.用以确定的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系,从体外或译体系中检测出蛋白相互作用关系.步骤：Step1:从裂解液中固定化融合标记的“诱饵蛋白Step2：洗脱未结合蛋白Step3:结合“猎物蛋白到固定化的“诱饵蛋白Step4：洗脱未结合蛋白Step5:洗脱蛋白质-蛋白质混合物Step6:通过 SDS-PAG 豉 Western 分析蛋白与蛋白的相互作用图片分析：totaltotalDaamlDaaml图5GSTpulldown技术检测HEK293T细胞中Dnaml的活性图5是利用GST-Pulld

6、own技术检测HEK293T细胞中Daam1的活性,GST-RhoA融合蛋白起到“诱饵蛋白的作用,“诱饵蛋白能结合到带有谷胱甘肽的琼脂糖球珠上,带有活性Daam1 的细胞裂解液经过琼脂糖球珠时会和 GST-RhoA 吉合,进而挂在琼脂糖球珠上,经过洗脱去除其它杂蛋白,再经过高强度的洗脱把 GST-RhoA+Daam1 洗脱下来进行 Western 鉴定活性 Daam1的存在.第一行代表有活性的 Daam1;第二行代表总的 Daam1;GST 列无条带表示：GST 并不能与 Daam1 结合,从而排出假阳性的可能性.GST-RhoA 虫合蛋白可以与 Daam1 结合,Western 显示出条带,

7、证实了 Daam与 GST 相互作用.参加 GTPS 是为了活化 RhoA,从而使其结合更多的 Daam1 进而提升整个系统的灵敏性和准确性.实验严谨性分析:artivrDaaudartivrDaaudadiveDaamladiveDaamltotalDaamltotalDaaml(STpulla)wn技术检测HEK293T细胞中Daaml的活性如果无 GST 条带,实验缺乏对照,如果 Daaml 也于 GST 结合,会对实验结果造成假阳性的结果.如果无 totalDaaml 条带缺乏内参对照.备注：(文献中其他图)800bp500bp200bpM;DNA标准；】：空白对照偏阳性克隆；3、4：

8、阳性克隆.图1重组原核表达载体阳性克隆的PCR鉴定图 1 对于构建的表达载体插入的目的基因进行 RCR 鉴定,说明目的基因片段的存在.,士.二+FJU匚3KhoAF划线分别表示起始密码子A和终止密码子B图2重组原核表达载体阳性克隆的局部测序结果62kD47kD32kDA20304050A20304050R59QR59Q 0041000410 2020图 2 是对于编码 RhoA 的目的基因序列进行测序进而证实该基因正确的存在.V123蛋白标准；空白BL21菌株未经IPTG诱导组：3JPTC诱导组口图3GST.RhoA重组蛋白在B121中的表达图3为GST-RhoA融合蛋白在大肠杆菌中的表达,通

9、过考马斯亮蓝染色证实重组质粒在大肠杆菌中成功表达.其中 IPTG 起到诱导 RhoA 蛋白表达的作用.12347kD-GST-KhoA32kl1：空白BL2I菌株；2：未经IPTG诱导组；3：IPTC诱导组.图4GST-RhoA重组蛋白的检测图 4 是对于重组蛋白 GST-RhoA 进彳 TWestern 特异性检测,证实 GST-RhoA 在大肠杆菌中特异性、 高水平表达.表达载体构建1 .获取目的基因从 genebank 中查询到海参溶菌酶基因EF036468原始序列,其 247-684 位是该序列的保守开放性阅读框ORF如下列图：atgatgttgccattagaaacaagacacat

10、taggtgttatatatcttttagacaatgtacctttgaatgattatttttaagggggcgcagtcgccacgtaagctggatggtttcagatatttcctgagacgcacaatacatttctctgacgtcaagattcgtgacgtcactcagcaatttttgacgaacatctgcgacagtataagtgaacgatcattaaacatagttgtagcagatcgcgccgaccatcttccacajataactaaatctttactctctcatcaatacatctfloacaaattccttctmttocctaaaatacatctottt

11、tataaaatccacttmiactatacottcocoattgtgtcat抗ggatgtag典tcactgtoatgtggtccttacc的成.aaact叫getactgqcaggatgctaggctg3明gg叫qtagtctgqatgg叫attggc叫amat范tc叫caacctttgactgcaqtg策cgggctgtmjaggqttatatgqcacggtacqcadcct就qcccqtctaqaqcataatcctacct优口却qattttqcqcqqatacKaacqqcqccaaatqqqttc晶satcc/caacRaaaaatatRqttqaq训tqaaqaaatetot

12、t虱3tmcaac阻戊口3爪阻式ctcaacttaataaaaaaaaaaaa2 .引物设计上游引物可从保守序列,即第 247 位开始选取连续的 15-20 个碱基,下游引物那么从 684位反向选取碱基注意应为 3 的倍数,以预防移码导致阅读框的改变,估算两个引物的 GC 含量及Tm.Tm 可按以下公式估算：Tm=4G+C+2A+T.一般 Tm 以 55-80摄氏度之间为宜,GC含量在40%-60%之间.引物的5端可以进行彳饰,而3端不可修饰,这是由于DNA的合成是从 5 端向 3 端进行的.因此引物的 3 端碱基序列应尽量与模板互补配对,尤其是最后的 5 到6 个核甘酸序列.此外,由于天然的

13、原核表达载体上只有一个启动序列,为保证目的基因后的报告基因能正常表达,故引物的 3 端必须去除终止密码子,预防重组载体的蛋白表达停止.5 端可根据需要选择适宜的酶切位点进行修饰编辑目的基因应不含有该酶切位点.为了保证其酶切的特异性,可参加保护碱基,但要注意引物的长度不能过大,而使退火温度过高.保护碱基的添加有专门的保护碱基对应表,可根据不同的酶切位点选择适宜的保护碱基.其他考前须知包括预防出现大量重复碱基、 3 端最后 5 个碱基不能出现多于 2 个 G 或 C、预防出现同源二聚体、错配等等,引物设计完之后可进行 Blast 比对.无误后引物合成.3 .PCR 扩增目的基因4 .琼脂糖凝胶电泳

14、跑出条带后胶回收.ORIGIN1611211812413013614214815416016615 .提取质粒6 .对质粒和目的基因进行酶切和连接Administrator邻苯二胺(OPD)(OPD)3、考前须知:适宜的底物,辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度1、底物：对待测酶有较高的特异性；Km 值小,以使 Vmax 时的底物浓度低,降低试剂本钱,预防出现底物难溶现象；底物浓度适宜,多数酶 Km 在 10-3-10-5mol/L,底辣根过氧化物酶用?万NHNH十2%02%0(橙红色)4、碱性磷酸酶APAP注意将目的基因连接在启动子/启动序列之后7,鉴定一般包括：重组质粒的测序、双酶切的鉴定等

15、.1酶活测定一分光光度法2、对硝基苯磷酸酯葡糖酸6 6磷酸+恒H+H+GalactoseGalactose(cnlorles(cnlorles) )葡萄糖-6-6-磷酸+NADP-+NADP-3 一半乳糖昔?/rX?*340nm 处有高的吸收G-6-PDH*葡萄糖-6-6-磷酸葡萄糖+ATP+ATP物浓度最好为 Km 的 20-100 倍,一般不可低于 10 倍2、辅因子、活化剂的种类和浓度：如辅酶、辅基、离子以及其他加速酶反响的物质3、变构剂的种类和浓度：边沟没的反响速度和底物浓度呈 S 形曲线,变构剂分为变构激活剂和变构抑制剂,影响变构酶和底物的作用速度,不同浓度的变构剂改变曲线的形状,测

16、变构酶活性浓度时,一般在饱和浓度的变构剂的条件下进行二、选择酶最适反响系统1、缓冲体系的 pH:最适 pH 时,V 最大2、离子种类和强度3、温度4、其他影响酶活的因素：氧化剂,氧化酶蛋白中的甲硫氨酸、络氨酸、色氨酸残基使酶失活)；外表活性剂(Tween-80、Brig-35),抑制酶活；抑制剂三、确定反响时间选用产物生成与反响时间呈线性关系范围内的时间点为测定选用的时间四、酶液稀释度对酶活测定的影响稀释可能降低酶的稳定性,降低样品中原有抑制因素和辅因素的浓度,而且许多酶活力和稀释倍数成正比.酶分子与底物分子的数量比列中有在适当的范围内时酶的活力与产物生成才成线性正比例关系.稀释倍数过大影响酶

17、的稳定性,A 值过小结果偏低；稀释度低,吸光度太大,使结果大大偏低.应使吸光值在 0.2-0.5 之间可得相对稳定的测定结果.五、标准曲线制作时尽可能和样品在同一条件下反响,以减少系统误差.吸光值和产物应为线性关系范围,酶样测定值在线性范围内.六、显色剂的配制对酶活测定的影响显色剂的类型,其中各物质的配比、在反响中的添加量、显色时间七、对照系统设置对照体系,排除系统中非酶因素干扰,保证测定值的准确性.离子交换层析别离纯化未知蛋白原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行别离纯化的.由于是未知蛋白,蛋白质的电荷性质、等电点和分子量等都是未知的,因此离子交换剂的选择

18、和与缓冲液 pH 值的选择都需要探究.1、离子交换树脂的选择依据被别离物质的性质和别离目的,保证别离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异.一般而言：酸性物质用阴离子交换剂别离,碱性物质用阳离子交换剂别离.类型包括：阴、阳离子交换树脂、强离子交换树脂和弱离子交换树脂；层析时液相流速要适中,让蛋白有足够的时间吸附在树脂上；树脂吸附容量在 10%-20%,一般选用强离子交换树脂,它能够提供更好的重现性.2、缓冲液 pH 值的选择首先未知蛋白不能与缓冲液发生反响,其次是确定蛋白质等电点,最常用的方法是等电聚焦电泳.通过氨基酸序列推测出的等电点常与表观等电点相差一个单位.当蛋白质因不纯而不能进行等

19、电聚焦电泳时,要确定溶液 PH 值得简单方法步骤如下：(1)在九个试管中各放入 1ml 阴性离子交换树脂(如 DEAESepharoseCL-6B(2)用 10ml0.5mol/L,pH 值为 5.0 的缓冲液润洗一号试管 10 次后；参加含 10mmol/LNaCL 的缓冲液平衡树脂.二号试管以 pH 值为 5.5 的缓冲液同法处理；以后各试管所用缓冲液 pH 值依次增加 0.5 个单位.(3)去掉多余缓冲液,保证各试管中缓冲液高出树脂量为 1ml.(4)向各试管中参加 100ul 蛋白质溶液.(5)混匀试管中物质,放置几分钟.(6)检测上清中是否存在目的蛋白.(7)上清中不存在目的蛋白就是

20、所需 PH.3装柱先把柱内装满起始缓冲液,用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后参加,柱内的交换剂应非常均匀地分布,不应出现节面和气泡,不能干柱,床面要平整,床高距柱顶 23cm 为宜.4 平衡缓冲液平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液.平衡缓冲液的离子强度和pH 值的选择首先要保证各个待别离物质如蛋白质的稳定.其次是要使各个待别离物质与离子交换剂有适当的结合,并尽量使待别离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差异.般是使待别离样品与离子交换剂有较稳定的结合.而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定.5 上样离子交换层析的上样时应注意样品

21、液的离子强度和 pH 值,上样量也不宜过大,一般为柱床体积的 1%-5%(体积分数)为宜,以使样品能吸附在层析柱的上层,得到较好的别离效果.将柱中的缓冲液逐渐放出,使顶部液面到达近于柱床面时开始加样.用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环参加酶样,待样液达一定高度后再在柱中间小心加样.待样液刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱,洗出未被吸附的物质.6 洗脱缓冲液在离子交换层析中一般常用梯度洗脱,通常有改变离子强度和改变 pH 值两种方式.改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度,从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来;而改变 pH 值的洗脱,对于阳离子交换剂一般是 pH 值从低到

22、高洗脱,阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低.由于 pH 值可能对蛋白的稳定性有较大的影响,故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱.7 洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析别离效果,洗脱速度通常要保持恒定.一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好,但洗脱速度过慢会造成别离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用,所以要根据实际情况选择适宜的洗脱速度.如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠,那么应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提升分辨率；如果分辨率较好,但洗脱峰过宽,那么可适当提升洗脱速度.8 样品的浓缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高,而且体积较大,样品质量分数较低.所以一般离

23、子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理.另外在层析别离过程中还要注意操作手段和溶液环境,如温度、压力和缓冲系统对欲别离物质稳定性的影响,预防被别离物质失活.课题设计1.什么是调控序列调控序列就是一段限制基因表达的DNA片段调控序列主要有以下几种:在5端转录起始点上游约2030个核昔酸的地方,有TATA框(TATAbox).TATA框是一个短的核昔酸序列,其碱基顺序为TATAATAAT.TATA框是启动子中的一个顺序,它是RNA聚合酶的重要的接触点,它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录.当TATA框中的碱基顺序有所改变时,mRNA的转录就会从不正常的位置开始.在5端转录起始点上游约708

24、0个核昔酸的地方,有CAAT框(CAATbox).CAAT框是启动子中另一个短的核昔酸序列,其碱基顺序为GGCTCAATCToCAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点,它的作用还不很肯定,但一般认为它限制着转录的起始频率,而不影响转录的起始点.当这段顺序被改变后,mRNA的形成量会明显减少.在5端转录起始点上游约100个核昔酸以远的位置,有些顺序可以起到增强转录活性的作用,它能使转录活性增强上百倍,因此被称为增强子.当这些顺序不存在时,可大大降低转录水平.研究说明,增强子通常有组织特异性,这是由于不同细胞核有不同的特异因子与增强子结合,从而对不同组织、 器官的基因表达有不同的调控作用.例如,人类

25、胰岛素基因5末端上游约250个核昔酸处有一组织特异性增强子,在胰岛素0细胞中有一种特异性蛋白因子,可以作用于这个区域以增强胰岛素基因的转录.在其他组织细胞中没有这种蛋白因子,所以也就没有此作用.这就是为什么胰岛素基因只有在胰岛素B细胞中才能很好表达的重要原因.在3端终止密码的下游有一个核昔酸顺序为AATAAA,这一顺序可能对mRNA的加尾(mRNA尾部添加多聚U)有重要作用.这个顺序的下游是一个反向重复顺序.这个顺序经转录后可形成一个发卡结构.发卡结构阻碍了RNA聚合酶的移动.发卡结构末尾的一串U与转录模板DNA中的一串A之间,因形成的氢键结合力较弱,使mRNA与DNA杂交局部的结合不稳定,m

26、RNA就会从模板上脱落下来,同时,RNA聚合酶也从DNA上解离下来,转录终止.AATAAA顺序和它下游的反向重复顺序合称为终止子,是转录终止的信号题目研究一个真核细胞基因的上游限制序列在该基因表达调控的作用.1 .通过基因组文库(genomiclibrary)筛选克隆启动子的流程为： 构建适当丰度(abundance)的文库,用与待克隆启动子相关的序列片段或特异基因片段作探针(probe),与文库杂交,筛选出含有目的启动子的克隆,最后经测序、活性分析确定启动子序列.12 .探针载体筛选法克隆启动子的流程为： 将DNA消化产物与无启动子的探针质粒载体重组,并使克隆片段恰好插在报告基因(repor

27、tgene)游,再把重组混合物转化寄主细胞、构建质粒载体(plasmidvector)基因文库,最后检测报告基因的表达活性.例：2将已构建成功的 PHO81LacZ 质粒分别以限制性内切酶 BamHI、Hind1、Pstl、Xhol作酶切,通过琼脂糖电泳筛选出含 PHO81 基因 5端上游不同长度的 PHO81-LacZ 基因片断,将此片段分别插入大肠杆菌一酵母穿梭质粒 YEP13 中.重组子转化酵母菌 YPH 一 499.含有PH081LacZ 融合基因表达质粒的酵母接种于 3mlYPD 中,30C 振荡培养过夜,离心收集细胞；用无菌水洗涤二次,按 02OD600/ml 接种量分别转接到 3

28、ml 高磷或低磷 Burkholder 培养液中.30C 继续培养 20h,收集菌体,以 ONPG 为底物,测各半乳糖昔酶的活力.3 .酵母单杂交分析法4 .(其他方法可以看文献 1,我觉得有前面三种方法的答案就足够了,个人感觉第二种是最好理解的,也是第二篇文献中介绍的比拟清楚大家测试前选一种自己组织个详细点的答案测试顺利！)References:References:1 .杨晓娜等,启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展.云南农业大学学报(自然科学版),2022(02):第283-290页.2 .李江琪,吴建生与敖世洲,酵母PHO81基因上游调控序列的初步研究.江西医学院学报,1995(01

29、):第1-3页.校对报告当前使用的样式是Numbered(Multilingual)当前文档包含的题录共 2 条有 2 条题录存在必填字段内容缺失的问题参考文献1:字段(卷)内容缺失；参考文献2:字段(卷)内容缺失；比拟 BCA 法和 Bradford 法测定蛋白含量选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白县里.原理Bradford 法：在酸性条件,蛋白质与考马斯染料 G-250 结合,颜色从棕色变为蓝色,在 595nm 处检测吸光值然后与标准曲线比照,即可计算出待测蛋白的浓度.BCA 法：在碱性条件下,蛋白将Cu+复原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色络合物,测

30、定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线比照,即可计算待测蛋白的浓度.Bradford 法优点是：1.灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1ug.这是由于蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化大.2 .测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要 5 分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要 2 分钟即可完成,其颜色可以在 1 小时内保持稳定,且在 5 分钟至 20 分钟之间,颜色的稳定性最好.3 .干扰物质少.如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、琉基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法.此法的缺点是：1 .由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g 一球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的