westernblot超详细步骤

1、一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加 20ulcocktail ）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的 PBSg洗3次，每孔加入100屋裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至 1.5mlEP管中，编号置于冰上。2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理， 超声时间为3S,间歇时间为10S, 重复三次。3、于4c离心机（预冷）12000r离心15min,取上清，收集于0.5mlEP管中。二、蛋白浓度的测定（BCAt测定蛋白浓度）1 .取标准蛋白（2mg/ml）备用。2 .于标准蛋白稀释为 2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.2

2、5 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml, 96孔板中每孔加入10ul ,设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入 10ul ,设3个复孔，每孔加入 BCAT作液（A液：B液=50: 1混匀）90ul , 37c 温浴30min,酶标仪测出各吸光度值，EXCEL俞入数据，绘制标准曲线。测出待 测蛋白浓度。测完蛋白含量后，计算含 30、50仙l蛋白的溶液体积即为上样量。 按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5XSDS上样缓冲液至终浓度为1 X。后蛋白于95c煮5min （干湿温箱预热）。样品于-80 C保存。三、电泳1 .制胶分离胶：电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.0

3、30加烯酰胺3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED( l) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 2精品30沏烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS (l) 4010%AP0 l) 30TEMED( l) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2、按前面方法配10%分离胶，加入TEMEDf混匀，加入TEMED!再次摇匀即可 灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取胶沿

4、玻璃放出，待胶面开到绿带中间线高度时即 可。然后胶上加一层水。3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，时间约 20min左右。用吸水 纸将胶上面水吸干。4.浓缩胶按前面比例加入，加入TEMEDJ混匀，加入TEME昉再次摇匀，快速灌 胶，可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出，约5min后浓缩胶凝固，插梳子时要使梳子 保持水平。放入4 c冰箱备用。2、电泳：1.配制电泳缓冲液(5X) : Tris 15g+甘氨酸72g+SDS5g+H2OE 1L,稀释为1X.2.取出胶板，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。加足够的电泳 液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内侧的电泳槽，外侧量可只到2/3。

5、)用枪头吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将枪头稍插入孔中缓慢加入样品。3、加样完毕，于冰上电泳，盖好电泳槽的盖子，(注意电极方向红对红，黑对 黑)，先以80V电压进行电泳15-20min左右，后调电压至100V,电泳直至澳酚 染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳，时间约1h30min左右(注意观察电泳液 是否泄漏)。四、转膜(1)配制转膜缓冲液(5X) : Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1L,稀释为1X, 放入4c预冷。(2)将PVDF真在甲醇中活化。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、 两块海绵垫、滤纸和浸过的膜。(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上

6、垫一层 加厚滤纸，注意不要有气泡。(4)要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反 复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶 轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去 气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上 盖1张加厚滤纸并除去气泡。最后盖上海绵，合起夹子。整个操作在转移液中进 行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(5)先开启4c循环冷凝水预冷， 将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑 面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，加冰降温。以250mA专

7、月M 3h0五、丽春红染色精品转完膜后用TBST浸润一下，将膜用1X丽春红染液染5min （于脱色摇床上摇）。 然后用TBST冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 再以TBST彻底洗去丽春 红染液。六、封闭：以5%勺脱脂牛奶粉溶于TBS-T中，将膜放入封闭液中封闭1h。七、抗体孵育1、标记Marker分子量，选择目的蛋白所在范围剪膜，将条带在一抗（参照说明 书比例VP16 1: 1000, ICP4 1 : 500）及内参（参照说明书）中孵育，封闭于 PE手套中，注意不要有气泡，加入约 2ml封闭液，后摇床上4c过夜。2 .取出一抗及内参中的条带，用TBSM水平摇床中洗脱4次，每次5min。加TBST 10ml于50ml离心管中，加入相应二抗（注意羊抗兔