脲酶Km值的测定

1、脲酶Km值的测定、背景与目的Km值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。测定Km在研究酶的作用机制、 观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等中均 具有重要意义。当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度S增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：* Km + &对于K值的测定，我们通常采用 Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。具体做法 为：取米氏方程式倒数形式。1Km t VV V若以1/v对1/S作图，即可得下图中的

2、曲线， 通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K值。本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。通 过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度(单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比)。具体反应如下：(1)酶促反应NH；OH()NH1C=O +H孔一-C=C)十 NHjC=<)2NH3 + H2CO31NH；-NHZNHZ J(2 )呈色反应NHQH十2(HkJ * 2KI)+ 3NaOH通过本实验学习大豆脲酶的提取方法；掌握脲酶米氏常数Km勺测定方法。仪器与试

3、剂1. 仪器(1) 721型分光光度计(2)恒温水浴锅2. 试剂0.05mol/L 尿素溶液 0.1mol/LpH=7.0Tris-HCI 缓冲液10%Z nS04溶液 0.5mol/LNaOH 溶液(5) 10%酒石酸钾钠溶液奈氏试剂 三实验方法1. 脲酶提取液的制备(由老师准备)2. 取5支试管编号，按下表加入试剂和操作，加入试剂量单位为 mL试管编号012340.05mol/L 尿素0.251.000.500.400.25每管中尿素的mol数51.25 X 10-55X 10-52. 5 X 10-52X 10-51.25 X 10-蒸馏水0.75一0.500.600.75PH=7Tri

4、s-盐酸缓冲液3.003.003.003.003.0025 C恒温水浴，预温 5min脲酶提取液一0.100.100.100.10煮沸的脲酶0.10一一一一25 C恒温水浴，准确作用10min10%Z nSO1.001.001.001.001.000.5mol/LNaOH0.200.200.200.200.20充分混匀，过滤另取5支试管，与上述离心管对应编号，如下操作上清液0.500.500.500.500.50蒸馏水4.004.004.004.004.0010%酉石酸钾钠0.500.500.500.500.50钠氏试剂1.001.001.001.001.00混合均匀，以对照管调零，在480n

5、m处，读取各管的A48o4值A180 nrt值以酶促反应初速度的倒数为纵坐标（以 1/ A 480nm代替），以保温混合液中脲酶提取液浓度，以mol数计的倒数为横坐标，按双倒数作图法，求得K值1/ A 480nm1/SKm82164205328参考数值Km*S=每管中尿素的mol数/4.1mL X 10 -3 （4.1mL为酶促反应总体积）五、 注意事项 (1)米氏方程系线性方程，酶促反应初速度v与光吸收值A成正比，所以用1/A代表1/v作图求K值，方法简便，且结果不受影响。( 2 )本实验为酶的定量实验，因此，酶促反应所要求的底物及酶的浓度、酶作用的条件及时间要求严格掌握，所加试剂量必须准确。( 3)试管应洁净干燥，否则不仅会影响酶促反应，而且会使钠氏试剂呈色混浊。( 4)加奈氏试剂时应迅速准确，立即摇匀，马上比色，否则容易混浊。实验中加入酒石 酸钾钠，目的在于防止奈氏试剂混浊。(5)加入ZnSO科以吸附酶蛋白，起助滤作用。另外，ZnSO4起终止反应的