细胞工程考试复习重点

1、绪论生物技术：生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。生物技术的主要范畴：基因工程，发酵工程，生化工程，蛋白质工程，酶工程，细胞工程第2章 ：实验室设置及一般技术培养基的组成和配制：组成：无机盐（不同植物生长发育所需无机盐在数量上可能存在一定的差异，但从无机盐的类型上看，所有植

2、物是一致的。一种类型的离子可以由一种以上的无机盐提供。避免由单一化合物提供某一营养元素时，在培养中因培养物对不同离子的吸收差异而产生的培养基pH的剧烈变化。），有机化合物（糖类：C源，维持培养基渗透压。植物组培常用蔗糖。维生素：参与酶的形成，与植物蛋白、脂肪代谢相关。肌醇：本身不促进生长，但它在糖类的相互转化、维生素、激素的利用等方面具有重要的促进作用。腺嘌呤：合成细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌呤有利于细胞协调自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。氨基酸：蛋白质的组成成分。），生长调节物质(生长素类:生理作用：促进细胞分裂和生长，有利于细胞脱分化并启动细胞分裂，有

3、利于形成愈伤组织。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。常用生长素：有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。使用2,4-D时，须严格控制使用浓度和培养时期，高浓度的2,4-D常常抑制器官的发生。细胞分裂素类:作用：促进细胞分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。离体培养中，细胞分裂素能促进不定芽的发生。常用细胞分裂素：KT (激动素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素等。近年来TDZ（苯基噻二唑基脲）亦作为一种新的细胞分裂素在许多离体培养研究中使用。赤霉素类:作用：促进细胞的伸

4、长生长，与生长素协调作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。在某些情况下，赤霉素对于生长素和细胞分裂素具有一定的增效作用。大多数情况下，培养物本身的内源赤霉素已能满足其生长发育的需求，只在特殊情况下须添加，且需严格控制浓度.)，水(离体培养中，水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分。不同试验要求使用不同级别的水。存放水的容器应注意！)，其它附加成分(琼脂：非培养基的必须成分，根据培养类型确定是否要求添加。浓度高，硬，影响营养物质的吸收；浓度低，凝固性差，起不到支撑作用。活性炭：吸附剂，可吸附培养过程中产生的一些有毒物质。选择性差，受温度影响) 配制：

5、先配成母液，使用时按比例稀释。按顺序添加。实验室的基本要求：实验准备（培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等），无菌操作，控制培养基本技术：洗涤 灭菌 培养基组成及配置 外植体处理实验室灭菌方法：物理方法：干热、湿热、射线处理、过滤等。化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。培养基灭菌：高压蒸汽灭菌或过滤灭菌（严格控制培养基的灭菌时间和温度）。湿热灭菌：灭菌后及时干燥，以免再次污染，101.3KPa，121，25-30min 干热灭菌：160-180，40min 120，2h培养条件的控制：光照调节（强度、时间和光质，光照调节是分阶段进行的：外植体培养初期和愈伤组织增殖阶段，黑暗或弱光。器官分化阶段，

6、高强度光照。光质研究报道较少。蓝光诱导烟草愈伤组织成苗，红光则不能成苗。 ），温度调节（适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量增加），pH调节（通常使用的pH值范围是5.5-6.5 pH变化的原因：外植体对各种成分吸收的差异 代谢产物的释放 高温灭菌），气体调节（培养室的透气程度和培养容器的封闭程度影响气体交换，影响培养物的生长状态。 培养器皿的密闭性：捆扎松紧度和材料透气性。固体培养，组织完全浸入培养基，停止生长。液体培养，振荡培养可改善通气条件。小规模培养，培养室的透气程度影响不大；批量化大规模生产，应考虑空气交换。 ）第三章： 细胞全能性与形态发生细胞全能性：是指一

7、个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。细胞全能性的相对性：1不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应。2即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。3动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。植物细胞按照分裂能力分为三类：胚性细胞植物干细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞。永久失去分裂能力的终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞。在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的Go细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation

8、）。离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前 。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。细胞的脱分化过程可分为3个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。细胞脱分化与愈伤组织形成：细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂。对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂发生在细胞完全脱分化之后。器官、组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位。愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱

9、分化的过程。有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。在组织器官培养时，愈伤组织内的细胞脱分化程度不一致。细胞的再分化：在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。再分化的过程事实上基因选择性表达与修饰的人工调控过程。极性（polarity）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。植物细胞分化中的一个基本现象。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。体细胞形态发生：生物个体形成是通过

10、形态发生实现的，建立在离体培养上的形态发生称为体细胞形态发生 。离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根和芽。植物经过再分化形成完整植株的途径：器官发生，体细胞胚胎发生器官发生的方式：先芽后根，先根后芽，根芽同步发生外源激素进入细胞内以后，以自由和束缚两种形式存在。（细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内以自由碱基形式（活化形式）和核甘形式（钝化形式）两种形式存在。通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细胞中降低细胞分裂素活性的主要机制。生长素进入细胞后，

11、一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体。游离状态才是活化形式，具有诱导和调控作用。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸，也有谷氨酸。生长素种类不同，生成生长素氨基酸复合体的能力不同。）体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。体细胞胚与器官发生形成个体途径的区别：体

12、细胞胚发育再生植株两个明显的特点是：双极性和生殖隔离。在形态上，胚性细胞分裂形成的多细胞原胚始终被厚壁所包围，与周围细胞形成明显界限，只通过胚柄类似物与外植体或愈伤组织连接。而经愈伤组织的器官发生，一般起源于多细胞，试验中再生植株常常出现嵌合体现象.体细胞胚与合子胚形成个体途径的区别：区别主要体现在形态结构和生理特性上。体细胞胚与合子胚比较，具有以下特点：一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构；子叶常不规范；体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异，不能有明显的脱水干燥过程；没有明显的休眠期，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。体细胞胚的结构特点：胚性细胞分裂形成的多

13、细胞原胚始终被厚壁所包围，与周围细胞形成明显界限，一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构；子叶常不规范；体积明显小于合子胚.第四章离体培养下的遗传变异1.由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。 2.从对生物遗传的影响上讲，细胞工程技术具双重性：稳定性：对繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞或组织或个体的复制,一般具有较好的遗传稳定性。变异性：细胞工程的另一类技术操作，其目的就在于创造变异，如体细胞人工突变、体细胞融合等。这些离体操作技术，在某种程度上说具有一定的

14、目的性和方向性，可以产生新性状，达到人类预期的要求。 3. 离体培养下变异特点 ：变异的普遍性（单个变异体，变异性状单一；同一培养体系的再生群体，变异具有多样性。变异发生在各种培养类型中。不同培养类型变异频率不同。） 变异的局限性（从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。） 嵌合性（体细胞变异常以嵌合体的形式存在。 指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞。 愈伤组织细胞具有多种染色体水平。再生植株中也广泛存在嵌合体）4. 以分生组织为外植体的再生植株通常可以

15、维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。以分化组织为外植体的再生植株容易发生体细胞变异，其频率与分化程度有关。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。第5章 植物组织与器官培养1.从技术上说植物细胞工程是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术。从遗传的角度来讲它具有遗传的保守性和变异性。保守性：植物的脱毒快繁、建立种子资源库、生产有用次生代谢产物等。变异性：体细胞诱变、体细胞杂交等。2.植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产，提

16、高繁殖系数。植物脱毒与快速繁殖的意义：1、能够有效保持优良品种特性2、生产无病毒种苗，防止品种退化3、快速推广优良品种4、节约耕地，提高农产品的产出率5、便于运输3植物脱毒的原理：病毒在植物体内的分布具有不均匀性4影响脱毒效果的因素：1.母体材料病毒侵染的程度：单一病毒感染的植株脱毒较易，复合侵染的植株脱毒较难；2.外植体的生理状态：顶芽易于侧芽，生长旺盛季节的芽易于休眠芽；3. 起始培养的茎尖大小 ：越小脱毒效果越好。5离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁6离体无性繁殖的一般技术流程：分四个

17、环节：1.无菌培养物的建立;2.培养物的增值;3.生根培养化;4.生产用苗的培植。1. 外植体选择（繁殖对象的品种典型性。植物在自然条件下的繁殖特点。离体条件下茎芽的增殖方式。外植体的取材部位和大小、生理状态顶端的幼嫩组织。）2. 增殖方式（腋 芽 增 殖：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。不定芽增殖：从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称之为不定芽。特点：繁殖系数高；遗传稳定性较好；但继代次数有限。体细胞胚增殖：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠

18、的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术。愈伤组织增殖 ：所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。经历了组织培养的全部过程。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁。）3关于试管苗生根与炼苗（生根培养：生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定。 生产用苗的培育：炼苗假植定植生产用苗。）7外植体的增殖方式及特点：腋芽增殖，特点：1.培养方法简单

19、;2.能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖;3.一般不需要添加外源激素。不定芽增殖，特点：繁殖系数高；遗传稳定性较好；继代次数有限。体细胞胚增殖，特点：增长率高；双极性免去生根环节；胚状体休眠的诱导和解除难以把握，这使得其成苗率不高。愈伤组织增殖，特点：成功率高，繁殖系数大；遗传稳定性较差。8花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。花药是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。9花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。花

20、药培养与小孢子培养的目的是为了获得单倍体(具有性细胞染色体数的植株）。10花药培养过程的取材时期：单核中晚期至双核早期花粉培养的取材时期：四分体至单核早期11花粉和花药培养植株的再生途径：12花粉培养的方法：直接培养（从不经预培养或预处理的新鲜花药中直接分离出花粉粒，接种到培养基中进行培养的方法。某些植物，在培养基中添加花药提取物后可得到再生植株。花药提取物：花药于培养基上培养一周，浸入刚煮沸的水中，10个/ml，研碎，离心，取上清。），预培养（花药先在液体培养基中漂浮培养2-4 d，然后挤出花粉，离心纯化悬浮于液体培养基中培养。），哺育培养（在合适培养基上培养裂开的花药作为一种哺育组织（同异

21、种植物均可，需诱导频率高），将预培养的花粉接种到这种花药里进行哺育培养。），看护培养（取适宜发育时期的蕾消毒，取出花药；按上述介绍的方法分离小孢子，将小孢子细胞密度调整到0.5ml含10个细胞的密度；在配好的半固体培养基表面横放几个(4个)完整花药，再在花药上平放上灭菌的滤纸片；取0.5ml(10个细胞)花粉悬液接种于滤纸片上，将接种的花粉悬液置于适宜条件下培养(一个月可长出绿色细胞团)。），微室培养（用滴管取一滴悬浮有花粉的液体培养基，滴在盖玻片上，然后翻过来放在一凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。），双层培养（先在培养皿中铺上固体培养基，凝固后在其上接种花粉悬浮液。固体培养基采用与花药培

22、养相同的培养基配方，附加5 ml/100 ml的花药浸提液（取50个花药在10 ml花药培养基中研磨，然后用80目筛过滤或在1000 rpm离心，取滤液加入到培养基中）。固体培养基灭菌后在凝固前加入到灭菌过的6 cm培养皿中，每皿铺约2 mm厚，等完全凝固后，在其上层接种密度为1×104的花粉悬浮液，接种量以1 mm厚的液层为宜。）13单倍体植株的二倍化：愈伤组织加倍：单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂及花粉核的融合，形成二倍体细胞；单倍体植株的器官于培养基上培养，形成愈伤组织，继代培养后可能会得到染色体加倍的植株。秋水仙素处理加倍14植物胚胎培养包括：胚培养、胚乳

23、培养、胚珠培养、子房培养 。幼胚培养取材时期在球形胚至鱼雷形胚，关键技术是胚剥离，胚剥离时应带胚柄，剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。15培养胚的生长发育方式：胚性发育（幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。），早熟萌发（幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的

24、丛生胚现象。），愈伤组织（在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。）16.胚性发育：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株的生长发育方式。早熟萌发：幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。17.被子植物胚乳按发育时期是否形成细胞壁分类：核型胚乳：胚乳最初发育经过一段游离核阶段，游离核阶段时间长短因植物不同而异。细胞型胚乳：胚乳初生核第一次分裂后即形成两个子细胞，以后每次分裂都形成

25、细胞壁。沼生目型胚乳：中间型，初生胚乳核第一次分裂为细胞型，以后两个细胞中的核进行游离核分裂。第6章 细胞培养与次生产物生产1. 植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。2. 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。3. 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。一般在30-50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。  均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

26、细胞生长迅速。悬浮细胞的生长量一般2-3 d甚至更短时间便可增加一倍。 4.悬浮细胞的生长动态: 延迟期；指数生长期；直线生长期；减缓期；静止期5.单细胞培养的方法：平板培养（平板培养是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。  单细胞的分离：酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。  单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml 。植板：将1份已调整好密度的细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。平板培养的效果一般用植板率来衡

27、量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例），看护培养，微室培养，双层滤纸植板培养（在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层上，然后将培养细胞植于其中。）6.细胞规模化培养的方法: 根据一个培养周期中是否添加培养基可分为成批培养、连续培养和半连续培养平p154.(植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基可分为成批培养、连续培养和半连续培养等。基本培养方式的选择应根据次生产物积累特点而定，通常还根据不同要求进行相应改进。当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，需用两步法建立培养体系

28、：先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。 1. 成批培养在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。优点：培养装置和操作简单。缺点： 培养检测十分困难（培养过程中细胞生长、产物积累、以及培养基的物理状态常常随时间变化而变化）； 成本高（周期较短，一个培养周期后细胞和培养液同时取出用于目的产物提取，下一个培养周期必须重新接种种子细胞）。 2. 连续培养在培养过程中，不断向反应器中流加新鲜培养基，同时以相同的流量从系统中取出培养液，从而维持培养系统内在细胞

29、密度、产物浓度以及物理状态相对平衡的培养方式。优点： 增加目的产物产量（细胞培养周期延长，导致目的产物积累时间延长）； 便于对系统的检测（系统进入稳定状态后，细胞密度、基质、产物浓度等趋于恒定）。缺点：连续培养装置相对较复杂，对反应器的设计要求更高3. 半连续培养基本方法是在完成成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。优点： 节省种子细胞培养的成本； 保留的培养液利于细胞分裂启动。缺点：影响下一培养周期的细胞生长一致性（由于保留细胞悬液中细胞状态有较大差异，特别是有些衰老细胞不能及时淘汰）。)7.植物次生代

30、谢产物的类型：酚类化合物，萜类化合物，含氮化合物8.培养条件下，植物次生代谢产物积累的特性：生长偶联型产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等。中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。如合成蒽醌类物质的植物细胞。非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。第七章 原生质体培养1原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。2亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就

31、叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。3核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体(cytoplast)：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。4.常用于原生质体分离的材料：试管苗叶片(优点：细胞排列疏松，酶易到达细胞壁；叶绿体为选择杂种细胞提供标记；不用灭菌；受人为控制，最适条件确定后，可提高试验重复性。缺点：生活力较弱。)，实生苗的子叶和下胚轴(优点： 易于消毒； 种子萌发易于控制，可保证实验材料的一致性； 生活力和分化能力较强。缺点：遗传上杂合程度较高，遗传分离较大，在改良品种

32、的个别性状方面不太适用。)，愈伤组织或悬浮细胞(原则：选用结构疏松并处于对数生长期的细胞。缺点：变异频率高。)5.原生质体活力测定,原理，现象1. FDA法原理：FDA本身无荧光，可透膜，进入细胞后，受内酯酶作用分解成有荧光的物质，紫外线照射产生绿色荧光。无活力的原生质体无荧光。有叶绿素的原生质体，黄绿色荧光为有活力，红色荧光无活力。2. 形态特征观察：形态完整，含饱满细胞质，颜色新鲜的正常球形原生质体为有活力的原生质体。同时，可根据胞质环流来确定原生质体活力。3. 荧光增白剂染色法原理：检测细胞壁的形成从而确定原生质体活力。结合于新合成的细胞壁上，400nm激发光产生绿色荧光。细胞壁分解则完全无荧光（或红色荧光），有活力的原生质体随细胞壁的再生会产生绿色荧光。6. 原生质体发育与植株再生首先经历的过程：细胞壁的再生(原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。表型上表现为体积增大，由原来的球形变成椭圆形。新合成的细胞壁可以用荧光增白剂染色后在荧光镜下观察，可见绿色荧光围绕细胞表面。只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂的阶段。)第8章 体细胞杂交1. 体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起随后导致两个细胞核物质融合