第十七章 临床检验方法学评价

1、12第十七章 临床检测方法学评价生物化学检验是利用各种检测技术和方法，研究人体组织、体液的各种成分及其含量，为临床疾病预防、疾病诊断、病情监测、疗效评价、预后判断提供准确可靠的信息。选择准确可靠的实验方法是提供准确可靠信息的重要中心环节之一。分析方法的选择，是临床检验质量控制的基础，而方法学评价则是分析方法选择的依据。同一种实验项目，往往有多种分析方法。每个实验室都必须根据自己的具体条件，选择 适当的实验方法。方法学评价的目的就是对一个备选方法提供可接受判断的科学依据。所谓的方法学评价，就是通过一系列的实验得出结果，并对各项实验结果进行周密的统计和分析， 得出一个方法应用于本实验室进行病人样品

2、测定时，可能达到的精密度和准确度线性范围以及其他应用特性方面的详细资料和数据，即为作出可否被接受的判断提供可靠的依据。方法学评价是科学实验，涉及不少基础实验技术和统计学方法，不可能让每一个检验人员都掌握，但一个临床检验实验室，如无一人掌握，要提高这个实验室的检验质量是很困难的。第一节 实验方法的选择一、实验方法选择的目的 实验方法选择的根本目的： 各实验室按照方法选择的原则结合自身条件，确定合适的某项目的检测方法。 保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了解，作出初步评估。二、实验方法的分级在临床生化检验方面，检测项目和测定方法繁多，并且新项目

3、、新方法不断涌现。国际临床化学联合会（IFCC）根据分析方法的准确性与精密度的不同，将其分为决定性方法、参考方法和常规方法三级。（一）决定性方法决定性方法（definitive method）准确度最高，系统误差最小；经过详细研究未发现产生误差的原因，其测定结果与“真值”最为接近。主要方法有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）等。由于技术要求太高，费用昂贵，这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于评价参考方法与一级标准品。国际上研究这类方法的实验室很少，美国、法国、德国、丹麦等国家有这类实验室。（二）参考方法参考方法（reference method）是指准确度与

4、精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。参考方法能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；用于鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。（三）常规方法常规方法（routine method）应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目的的需要。其中准确度已经确定即已查明偏差方向和数量的方法称为偏差已知方

5、法，而准确度不明者称为偏离未知方法。常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。临床生化检验部分项目的决定性方法、参考方法和常规方法见表1。三、标准物质的分级标准物质（即标准品）有许多名称，仍未统一。国际标准化委员对标准物质（参考物，reference material）作的定义为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，可用以校正仪器和某种测定方法的物质。标准物质是进行方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制等不可缺少的，在临床化学中将其分为三级。（一）一级标准物质（原级参考物）它是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经

6、定量。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（WBS）颁发证书，并指明其性质和有关数据。一级标准物质用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准物质”定值。（二）二级标准物质（次级参考物）这类标准物质可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准物质比较而确定。 二级标准物质主要用于常规方法的标化和控制物的定值。（三）控制物控制物用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。有定值血清和未定值血清两种。控制物不能用于标定仪器或方法。在控制物的制备、定值和使用过程中，应严格按有关规程进行。各级分析方法和标

7、准品的相互关系见图1。参考方法：用途：为二级标准品及控制物定值，评价常规方法（标准化、偏差、干扰因素）等）决定性方法用途：评价参考方法及一级标准品二级标准品用途：常规方法的工作标准及为控制物定值一级标准品用途：发展及评价参考方法，校正决定性方法及参考方法，产生二级标准品常规方法用途：服务性实验室的常规定量分析控制物用途：质量保证图1 各级分析方法与标准品的相互关系四、实验方法选择的原则实验方法选择要从实际出发，根据实验室的条件和检测要求确定适当的方法。条件优越的实验室应建立和选择参考方法，以利于对常规方法的评价和标准品的定值；一般临床化学实验室应结合仪器设备、技术力量、实验成本等因素，主要选择

8、常规分析方法和使用方便的参考方法。选择常规分析方法时，尽量选用国内外通用方法或推荐方法，便于方法的规范化和质量控制，要重点考虑实用性和可靠性两方面的性能指标。（一） 实用性 1微量快速 便于急诊，适合批量成套分析。快速即检测速度，是指一份标本操作一次所需时间以及在常规条件下单位时间（小时、天）内所能处理的标本数量。2方法简便 操作人员无需特殊培训；试剂种类少，最好是单一试剂，易于自动化分析。3安全可靠 试剂无毒，腐蚀性小，无需特殊防护措施。4成本低廉 无需昂贵试剂和仪器，每件成本费用与一次分析的标本数量有关，应区别单件标本及不同工作量时的费用。（二） 可靠性 所选方法应具有较高的精密度、准确度

9、和较大的检测能力，保证测定结果的准确性能满足方法允许误差限度的要求。五、实验方法选择的步骤（一） 广泛查阅文献广泛查阅已发表的相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，仔细分析方法特点。（二）选定候选方法根据实验室的设备条件、人员业务素质、工作量等具体情况，选择适合于本实验室具体条件的方法（候选方法）。候选方法确定后，应写出该法的原理、参考文献、所用仪器、试剂来源和纯度、标本收集要求、详细的操作步骤、结果计算和分析、参考范围、注意事项等。（三）候选方法的初步试验对候选方法应作初步评价实验。初步试验包括： 标准曲线和重复性； 质控血清和新鲜标本的重

10、复试验； 分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。通过对候选方法的初步实验使工作者熟悉有关技术，掌握各分析步骤要点，判断能否适合本室条件要求。根据初试所获得的资料确定是否有必要作进一步研究。第二节 实验方法的评价 候选方法经过初步实验作出符合实验要求的判断后，就需要对该方法进行系统评价。实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。根据评价实验所测得的结果和方法性能判断的标准，决定该方法是否可以被接受。一、方法评价指标实验方法评价指标包括精密度、准确度、检测能力等。（一）精密度精密度(precision）是表示测定结果中随机误差大小程度的指标。它表示同一标本在一定条件下多次重复测定所得到的

11、一系列单次测定值的符合程度。精密度自身无量度指标，常用标准差（S）或变异系数（CV%）表示。值得注意的是使用标准差及变异系数时，应说明实验的重复次数及其均值。1连续测定的精密度 在相同条件下，对同一标本连续进行n次重复测定结果的符合程度。在有限次测定情况下，一般用（总体标准差）的估计值S（样本标准差）来表达这种精密度。S=2重复性精密度（repeatability precision） 又称室（批）内精密度，指在相同条件下（同样方法、同一种试剂和标准品、同样仪器、在同一实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮n次重复测定结果之间相互接近的程度。重复性

12、（批内）精密度（Sw）的计算公式为：Sw= =式中为m轮（批）各次测定值的方差。先计算出m个平均值及标准差和方差，再将有关数据带入公式，即可求出Sw。用变异系数表示批内精密度的计算公式为：CV（%）=×1003再现性精密度（reproductivity precision） 又称室（批）间精密度，指在不同条件下（不同操作者，用不同仪器，在不同实验室和不同时间）采用同一方法对同一标本所获得的单次测定结果之间彼此符合程度。再现性精密度既包括了不同操作者的误差，也包括了不同条件下的仪器误差，所以对检验方法的再现性作估计时，所要采用的方法比估计重复性更为复杂。再现性精密度多用于实验室间的质量

13、估计，其标准差常称为室间标准差。室（批）间标准差，是在对室（批）间重复性试验结果进行单因素完全随机设计方差分析后进行计算。（二）准确度准确度（accuracy）是指测定结果与真值接近的程度，一般用偏差和偏差系数表示。偏差为重复测定均值（）与真值之差。偏差系数（CB）=|真值-|×100/真值。要知道准确度首先要知道真值，但真值通常是难以得到的。在实际工作中，通常用已知含量的标准品来检查分析方法的系统误差，确定分析方法的准确度。在没有标准品的场合，常用已确认的标准方法的测定结果作为标准值，来对照被检验方法是否存在系统误差，以确定准确度。准确度主要受系统误差支配（系统误差愈小，准确度越高

14、），也受随机误差的影响，所以准确度是表示测定结果中系统误差和随机误差的综合。公式表示为：A=+a 。 式中A表示准确度，表示已定系统误差的综合，a表示在显著性水平为a时，未定系统误差和随机误差合并后的不确定度。不确定度（uncertainty）是表达测定结果的一个组成部分，它表明被测标本中真值存在的范围，通常所说的误差是指测定结果与真值偏离的程度；准确度是指测定结果与真值接近的程度。可见误差和准确度从相反角度表达了同一事物。（三） 特异度和干扰特异度（specificity）即专一性，是指在特定实验条件下分析试剂只对待测物质起反应，而不与其它结构相似的非被测物质发生反应。分析方法特异度越高，则

15、测定结果越准确。干扰（interference）是指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应，但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低，这些非被测物质称为干扰物。如果分析试剂与标本中被测物质以外的成分反应，则属特异度差；如果加入的物质影响了被测定物与试剂间的反应，则是被干扰。例如用邻甲苯胺试剂测定血糖，除葡萄糖外半乳糖、甘露糖等也能与试剂反应，产生与葡萄糖相似的吸收光谱，引起正误差，这是特异度不足所致。GOD-POD法测定血糖中，尿酸可和由葡萄糖氧化酶作用产生的H2O2反应，使部分H2O2不能参与过氧化物酶的第二步反应，造成显色程度下降。尿酸本身未与试剂直接反应，但对该方法有干扰。（四）检测能力

16、检测能力即检测限度或检出限（detection limit），是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小值。空白读数是指由基质、试剂所得的读数和结果，以及由仪器或测定过程所产生的影响测定步骤的残余偏差。对于某一分析方法，应确定检出限，便于与其它方法的检测能力相比较，避免标本中待测物含量接近或低于检出限。确定检出限时，首先选择合适的空白标本，多次测定（一般20次）其吸光度，求得平均吸光度及其标准差；然后重复测定接近空白的标本，计算标准差；最后选定一合适的单值统计试验及可接受的机率作为有意义的水平。为简便计算，可用“空白读数+3S”代表检出限。二、评价实验评价实验包括重复性实验、回收实验、干扰

17、实验和方法比较实验。（一）重复性试验实验的目的是检测候选方法的随机误差。方法是对同一材料（标准液、质控液、标本等）分成数份试验标本进行多次分析测定，并计算其均数（）、标准差（S）与变异系数（CV）。1试验形式与方法（1）批内重复性试验：用同一份样本在短时间内用候选方法作多次（一般20次）重复测定。一般要求CV应小于5%，精密的分析或多次平行测定要求CV小于2%。（2）日内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数批重复测定。因在一天内重复测定数批，所受影响因素比批内多，所得CV值可能比批内大一些。（3）日间重复性试验：将同一标本分成数份，按方法每天测一次，连续测定20天观察结果变异。这样得到的C

18、V比天内大，能反映实际工作情况。（4）病人标本的平行双份测定：主要用在不易得到含有合适基质的稳定标本的情况下。选择一批病人标本（20100份），其待测物浓度不超过方法的分析范围，作一批或数批测定，每一标本均平行做两份，用双份测定结果之差（d）来计算S（S=），作为不精密度的指标。该法可设计成批内、天内、天间病人标本的平行双份测定，以反映批内、天内、天间差异。2作重复性试验时应注意的问题（1）分析标本选择：标准液、控制物、病人标本均可，视用途而定。批内重复性试验时，用标准液可以得到各种不同的浓度，较简便，代表了最好的重复性。若结果满意说明方法操作适宜，可进一步用其它标本测定，否则应改进方法或另选

19、方法。日间重复性试验时，用冻干质控血清较好，因其稳定方便，但应注意控制物和病人血清不一样，加入的某些稳定剂、防腐剂可能干扰某些成份的测定。用病人标本时应详细记录标本的特性，如混浊、溶血、药物等。（2）被测物浓度：宜选择在医学上有决定性意义的浓度（医学决定水平）进行试验。（二）回收试验回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力，用回收率表示。本试验的目的是检测候选方法的比例系统误差。1方法 将被测物标准液加入病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作基础标本；然后用候选方法测定并得到各自浓度。2计算 回收浓度=分析标本测得浓度-基础标本测得浓度。加入浓度= 回

20、收率（%）=3注意事项（1）准确吸量。加入浓度值是根据加入标准液体积及原标本的体积计算的，吸量稍有不准，就会影响结果。应选择经校正的吸管并按正规要求操作。（2）加入标准液后，最好使分析标本中被测物的浓度达到医学决定水平，总浓度必须在该测定方法的分析范围内。（3）加入标准液的体积在总体积中所占比例要少，一般在10%以内。若稀释过大，误差将有改变，甚至消失。（4）一般须作高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率。（5）加入标准液的体积和被测物需要增加的浓度决定之后，再计算标准液浓度。一般标准液的浓度比欲增加的浓度高10倍，因为标准液加入标本后，将被稀释10倍。例如病人标本葡萄糖浓度为3.

21、90mmol/L，加入适量标准液后使其达到6.70mmol/L，为使0.9ml病人标本加入0.1ml标准液后增加2.80mmol/L，应配28mmol/L的标准液。（6）为了减少随机误差对检测比例系统误差的干扰，在可能条件下，重复测定23次为好。4举例 某法测定血清葡萄糖回收率的标本制备和测定结果如下：（1）样本制备： 基础样本： 血清2ml+蒸馏水0.1 ml。 分析样本1：血清2ml+30mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。 分析样本2：血清2ml+50mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。（2）按操作要求测定上述样本，将相关结果填入表3-7。表3-7 回收实验检测结果 测定浓度（mmol/

22、L） 加入浓度（mmol/L）回收浓度mmol/L 回收率（%）基础样本5.88分析样本16.800.950.9296.8分析样本28.682.862.8097.9平均回收率=回收率的理想值为100%，实测值与理论值之差为比例系统误差的估量值。上例中平均回收率97.4%，比例误差为2.6%，表明一个标本葡萄糖浓度为6.67mmol/L，用该法测定值约为6.5mmol/L，误差为0.17mmol/L（6.67mmol/L×2.6%）。(三)干扰试验干扰试验是用来检测候选方法的恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。1方法 基本与回收试验一样，但在病人标本中加入的是疑有干扰或非特异

23、性反应的物质。将可能引起干扰的物质配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用候选方法对此两种样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质产生的干扰所引起的误差，即干扰值。干扰值=分析标本测得值-基础标本测得值2举例 尿酸对GOD-POD法测定血糖的干扰：（1）样本制备： 基础样本： 血清0.9ml+0.1ml蒸馏水。 分析样本1： 血清0.9ml+4mmol/L尿酸0.1ml。 分析样本2： 血清0.9ml+8mmol/L尿酸0.1ml。 尿酸标本：蒸馏水0.9ml+8mmol/L尿酸0.1ml。(2) 用GOD-POD法测定，结果

24、填入表3-8。表3-8 干扰实验检测结果葡萄糖测得值（mmol/L）加入尿酸值(mmol/L)干扰值(mmol/L)基础样本6.50分析样本16.200.400.30分析样本25.950.800.55尿酸样本0单位浓度尿酸使葡萄糖减少值=mmol/L表明正常血清尿酸0.4mmol/L，使血糖测定结果约减少0.28mmol/L。3注意事项（1）被试验的物质：可根据方法的反应原理提示可能的干扰物。一般应考虑的因素包括胆红素、溶血、脂血、防腐剂、抗凝剂等，一些药物和食物成分亦应考虑。胆红素采用加入其标准液；溶血采用机械溶血，制备溶血标本；脂血可对高脂样本作萃取前后对比。（2）加入干扰物的浓度及确定最

25、低可疑物浓度值：加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，尽可能达到病理标本的最高浓度值。在确证有影响后应测定在何浓度时，产生的误差在临床上无意义，即确定使分析结果影响临床应用价值的最低可疑物浓度值。（3）本试验检测的误差包括方法特异度不高和干扰物的作用所引起的误差。4消除干扰的常用方法（1）设立试剂和标本空白试验：试剂空白可以校正标本读数中试剂的部分，标本空白可以校正标本中被测物以外的其它物质的影响。（2）采用各种物理、化学的方法，分离除去干扰物。例如作无蛋白滤液以排除蛋白质的干扰，用脂溶剂进行抽提萃取而除去脂类的干扰。（3）双波长或多波长检测排除干扰。（4）误差较大又无法消除，则需对方法进行改进或更换方法。（四）方法比较试验（对比试验）比较试验用于检测候选方法的系统分析误差。对所得数据进行分析，可提供系统误差的性质（恒定或/和比例误差）。1方法 对一组病人的标本用候选方法和比较方法同时进行分析测定，观察二者之间的差异。这是考验候选方法是否可采用的重要措施。2比较方法的选择 在进行临床化学常规方法的评价时，最好选择参考方法作为比较方法，这样在解释结果时，可把方法间的任何分析误差都归于候选方法；若采用已知偏差法，则有部分误差来自比较方法（与已知偏差一致的那一部分误差），剩余的部分则属于候选方法；若采用未知偏差法，分析误差可能来源于二者之一或二者都有，难