考马斯亮蓝法测蛋白质含量

1、标准曲线制作一考马斯亮蓝法测蛋白质含量、标准曲线出所测一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查 物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项根本技术。二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩腺法3、Fol i n 酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一标准曲线制作一、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G 250 1 OOmg 溶于50ml 95%乙醇，参加1 00ml 85% H 3PO4,用蒸镭水稀释至1000m I ,滤纸过滤。最终试剂中含0. 0 1 % W/V考 马斯亮蓝G 2 50, 4. 7% W/V乙醇，8.

2、 5% W/V H3P04O 2、标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0. 1 5m o I /LNaC I 配制成 1 00ug/ml 蛋白溶液。二、器材：1、 722S型分光光度计使用及原理0。2、移液管使用。三、标准曲线制作：试管编号012345610Oug/ml标准蛋白 ml0.00. 10.20. 30. 40. 50.60. 15mol /L NaC I (ml)10.90.80. 70.60.50.4考马斯亮蓝试剂ml5555555摇匀，1 h内以1号管为空白对照，在 595nm处比色A 595nm2、以 A595nm 为纵坐标，标准

3、蛋白含量为横坐标六个点为1 Oug 、 20ug 、30 ug、40 u g 、50 ug 、60 u g ，在坐标轴上绘制标准曲线。1 、利用标准曲线查出回归方程。2 、用公式计算回归方程。3 、或用 origin 作图，测出回归线性方程。即 A59Snni =a X X +6一般相关系数应过 0.999 以上，至少 2 个 9 以上。4 、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。四、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品含量应处理在所测范围内，依照操作步骤 1 操作， 测出样品的 A595ntn ，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蚤白质含量。一般被测样品的漏 5罚值

4、在 0. 10. 05 之间，所以上述样品如果 A595 "值太大 , 可 以稀释后再测 A595nm 值，然 E 再计算。五、考前须知：1 、 玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要枯燥，防止温度变化。4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制磷酸缓冲液的配制一、药品的配制步骤一、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器。2、洗涤。怎样洗涤算干净？ (二) 、计算：1百分比浓度计算：1 )、 G/V 比例如配 1% NaCI, 称 NaCI 溶于 100m I 水。2 )、V/V 比 :例如配 75% 乙醇 1 OOm I , 75%X 100% = 100%X

5、X, X = 75ml 。取 75ml 无水乙醇， 加 2 5 m I 蒸馅水。乙醇：乙瞇：丙酮二 2: 1: 2 配 500ml, 各取 200 ml, 100 ml, 200 ml 混 合。3)G/V 比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe 的含量。2、摩尔浓度计算： 注:药品的分子量一般在标签中注明。1) 、0. 或 0. 1 mo I /L NaC I 配 100m LM二质量/体积(L)称取NaCI 0.1X0. 1 X40 二0.4g摩尔数=G (g) /摩尔质量2) 、0. 1 mMNaCI 配 1 OOm I(11 “毫摩尔数 / 体积(L)称取 NaC I 0. 1 X0.

6、 1 X40=0. 4g毫摩尔数 =点( mg ) /摩尔质量3) 、0. 1 uNaC I 配 10O m ImM 二微摩尔数 / 体积 L称取 NaC I 0. 1 X0. 1 X40=0. 4mg微摩尔数二 G ug / 摩尔质量 称取 NaC I0. 1 X0. 1 X40=0.4ug3、混合溶液配制的计算：如配 3 u M EDT A , 2. 25 mM NBT 以及 60uM 溶液 100m I ，用50mM 磷酸缓冲液配制。注意 ：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能 为 10Oml三、标量：1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移

7、液 管。2、 电子分析天平的使用。四、溶解：1、 根据药品配置要求选择溶剂。蒸镭水，双蒸水，无离子水等。2 、 只能用烧杯溶解。注意参加溶剂只能参加总体积的 2/3 左右，剩余溶剂洗 涤烧杯三次 左右，直到洗涤干净。小常识：药 品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根携分子式和 所学的 常识判斷药品的结构和性质特点包括溶解性质。如酸碱两性物质的配制 AA 、蛋白质、核昔酸等如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但 pH 应在被要求的范围内。 3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶如热较好。如：配 0. 1%的淀粉，水裕加热温度在 80-90- C ,过量会糊化。五、

8、定容：1 、 用容量瓶定容；2 、 用玻璃棒引流或用小漏斗 ;3、 用溶剂参加到接近刻度，然后用滴管参加到刻度。要求刻度与液体凹面相切 为止眼 睛可视；4 、 上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。注意不再定容了，防止溶液漏掉。六、装入试剂瓶，贴上标签。标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等七、清理实验场所二、磷酸缓冲液的配制。一、配制 0.2m o 1/1_ 即 0. 2M pH = 6. 8 的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠一磷酸 二氢 钠做缓冲液。选用药品：Na2HP04? 12H20 碱和 NaMPO 八1 2A0 酸配缓冲液 100m L书中说 明。二、计算：1 、 注：书中有

9、注明配置的量。2、计算： N azHPCL ? 12已0 称取 7 1.64X0. 1=7. 1 64gNaH2PO4? 1 2 战0称取 31.21 X0. 1=3. 121g3、含有不同结晶水的换算。书中配1 /1 5mol /L 的缓冲液配1L,书中用NaAHPCU ? 2出0需要11.87g/L 但用Na?HP O4 ? 1 2 H2O 需多少 g?1 1.87=17 8 /358 XX, X=23. 87g 。三、分别配制缓冲液各 100ml 根据需要确定配制的量。即:0. 2M Na 2HP04 ? 2H2OANaH2P04? 2H20210mlo四、按书中的量配制取量再混合。如： pH = 6. 8, 分别去缓冲对 49ml 和 51ml 。五、用 pH 试纸 cen i 索赔的