WesternBlot个人版概述

1、Western Blot实验方法一蛋白提取U切取组织,置于已经用记号簿标记好的EP管底,称重mg插入冰盒中,注意不同样品间所用剪刀、刀片、镶子等要擦拭干净.2、配置裂解液：980ulRiPA+10ull0%PMSF+10ul蛋自酶抑制竺!*混匀机混然3y每EP管中加裂解ItGlDWlm呼超声?血 - pulse-AMPL- start-O 5s停 5s循环linin,振幅25% AMPL参数?,再裂解30min.4,于4k冷冻离心机中预冷15min, 1200r/min.将裂解后的组织液离心15miru 取上清即为所提蛋白,至于一个试管内,用酶标仪测浓度,再高温变性,再上样, 多余的试剂置-8

2、0保、存, 工 用蝴小烧杯配制定量川的试汕KZmlH融冏*id考马斯魔蓝.+36ulH2O+4ul样品,另加一个标准品BSAlOiWml对照组,一个空白对照组.6、4倍上样缓冲液稀释成<1倍,耻3那么L上打液+10皿4倍上样:冲糠C熨色的,购置的,盛荡混合+离心,高温振荡机中变性,95.口： 5min,注意使离心液全部流于底部准备跑电泳&7、测595nm吸光度翻开盖预热301nH每次都将空白校正0,读取标准品对< p <><o P s » c ar 、丁» 8 o r r 9p -.RR - « » l > &

3、#171; »照组,样品组的吸光度,尽快.比色皿水洗+酒精洗j.8 .建 Excel：L Cx二Ax/A标.C/C芹lOug/ml,由30ul稀释至40U A朦已经知道的二般上样量为二 30ug,故;30ug上样量/0.75Cx=Vm nil由二,得：V用二A/Ax.4 二配胶1支提前配板：洗板,吹干,对齐,夹紧向下压,配别离胶E两块板10ml,灌胶,压水.观察是否漏液,出现分界面,配浓缩胶两块板4ml ,假设温度太 他木易黑5可耨分匐族中0%AP$,TEMED同时加倍促凝.将磁用潴杯洗净.干.配股:5%浓缩股10%分底胶10ml两快板15ml三快板4m1 1两块板6ml三块板H2O

4、4.0ml5 9ml2.7ml30%丙稀酰胺3.3ml5ml670ul1.0Tris-HCLZ5ml(L5Mr 3Xml0.50ml clom. no) (175ml10%SDS1001150ul© , 9I0%APSa香薪 脸触?鼬BZ 100闭150ul4iil6ul40 M4034Ml60ul60ul6ul八 榭0极钓期靠所需胺的体例限 根据比例配制度瓶,为铺膝平蹙下层股铺 好后立即up水封,待胶干后倒去上层up水并用滤纸吸干,按比例配制浓缩胶积 压胶,.最后上椅子注意孔数、厚度与玻璃板搭配补液.3、制好胶的玻璃板,仔细观察可以看到一条水平的折线一如假设不用,.浸泡在电 泳液军

5、 三上样及电泳；1；电部液的配制t up.水03g j甘氨酸18. 8g "如S Xk Og.2、将两块配好胶的玻璃板薄面相对,夹好注意对齐,预防漏液,中间倒入电泳液注意拿错电泳架,分为；有电机的和无电极的一般两块板的电泳液加 到下面的线下面,四块板就加到上面线的刻度下.3,假设电泳液不渗漏,即可拔去椅子Y注意两边同时用力,平整拔出罪 4、按上样量点样,每块板子第一孔为Mark f上样量为8T0ul,后面为样品,不用样品间换枪头令5、将点好样的胶板放入电泳槽,槽内加适量电泳液,注意正负极连接.6、翻开开关一调整电压80V小电流250mA时间30min开始电泳,结束后, 匚一丁：- 一

6、 -XX- - W *"%,调节电压110V?时间60min«!1!转膜叩水800乳,红江03gL甘氨酸C14.4g于4°C置于木装膜液的酿制;冰箱, o 42、按海绵大小剪滤纸C上下共8张工NC膜,放在电泳槽内,.使之与转膜液充分浸泡.3,将转膜夹翻开,透明面正极朝下,上面依次放置：海绵滤纸4张?、NC膜、胶带、滤纸4张海绵胶带与膜之间不要有气泡,然后将黑色面压 R :鼎融渔慧.北席一直要保持湿润.4、电泳完毕后,将玻璃板拆卸下来,薄板和厚板别离小心预防撬碎玻璃板久将带有胶的板子下方衬白色滤纸J读出Mark标记,用绿色小平板撬开玻璃板,脸缩胶去除,舞别离会切去左

7、上用以标轼正反甑 将按放入平皿,平衡30min；根据标记切胶切割时注意水平以 选取含有目的蛋白的胶条ASIC蛋白分子量7禽为星抗AM配作内参考招 为鼠拉兀 姊的蛋百胶条放在转膜液里浸泡L 七» r,O r -Ia,?亍> . r旷,：T rV« »k -0一下以减小外表张力,铺胶带时注意条带的左右顺序,用圆珠笔标记°5、放入4匕冰箱,连接电极,黑对黑,红对红广翻开电源,调整电压300V、 -a.o. 时间a. 5h,开始转膜.总蛋白上100-130, 40-55 < < > O w. 4 * u 4 . * 4 I六封闭"

8、;配制TBST缓冲液:UP水 鹿制血?汴acL短：5面,tr晶麻兔,用盐酸调Eh值至 7, 5-7. 6 (4 管 0. 9mlHcl)最后加 Tween20 (500mL)注意 Tw*n20 粘稠,将检头去尖嘴后吸取.限配制封闭液：一般I配制的是褥£5%:40mlTBST+“0gB劭,置于整料器也或半 < * o p . e . . . n"« /./. .<f 6 .6 , . .个牛奶盒中泼于摇床摇匀L 0小时.3、一抗孵育:1 1%的BSA配制:称取0. 04gBSA加到装有4mlTBST溶液的4血小管中小2配制一抗缓冲液配制集的脱脂奶粉与TB

9、ST液中CW/V,按11200稀释A51C工2用压塑机做塑料袋先封住相邻两边,每边封两道防漏,尽量撑展上将膜取出移入塑料袋中,标记r正面向上电然后再封住一边,参加一抗缓冲液5mL排气泡,封最后一边；放在4匕冰箱的摇床上摇动正面朝上,尽量用最快速度,过夜一般大于18小时r 五丁 rr7* 3.剪开塑料袋.将膜取出放入皿中用一定量的TBXT洗膜,10minM3次,一抗回收,放入冰箱.4、二抗孵育：1遥的BSA配制：称取0. 04gBSA加到装有4mlBTST溶液的4mL小管中号心二抗簿冲浪的配制；配制居的脱脂奶粉与:TBST液中“盯泪jW HRP标记的二抗 GLU 用免抗：1:3000, B-ac

10、tin 用鼠抗：1: 30.0 |IE返用庭I机做塑料袋先封住相晒边一每边封两施彝 尽量等展, 耨膜取出移入塑料袋中,标记正面向上J然后再封住一边,参加二抗缓冲液5mL b pa q. P p °. 0 n 排气泡,封最后一边；：放在摇床上摇动L 0小时.E面朝上,尽量用最快速度,13剪开塑料袋f将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜,lOminXB次原七化学发光检测L取出化学发光试剂盒4C避光保存,在开启之前平衡至室温.黑白瓶各取 2mL共4ml i要求的体积是膜面积X0.125ml为吹打混匀即垫保鲜膜,将膜正 弋,.,一.4 <S Cl * .rd4ft 4 . 面朝上置于

11、保鲜膜上,加21nl混合的检测试剂于膜上,饭盒盖盖住,室温孵育5min;吸掉发光液放入化学发光仪Oni'a 16ic内传测工枇学发删I光上0一 ISmiru 2、W Western Blot产物进行条带灰度分析.用GrI-Pio.Analyzer专业分析建件读取10D值一以目的蛋白的I0D值/内参的I0D值半定量蛋白的水平.结果进 < V» "" , »,° 0 » «"OO » » *o «« ,« »行方差分析？以*0.05为具有统计学意

12、义*Western Blot 实验成功完成Wesmm Bim检测,必须满足4个条件* 1凝胶洗脱i转移期间蛋白质必须从凝胶中优脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进杼分折2吸附到膜上: 在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附匕将无法在膜上进行分析3处理 期间仍截留在膜上：在I%后的处理过程中雪白质必须保持吸附在印迹膜上4处理过 程中可接近:被吸附的蛋白项必须能够与检测试剂接触？如果蛋白膜被掩盖那么无法检测 成 功进行WH检测算那么设置 一.的；T是必不闻沙的一只要正确设置了这些懒G题用 快速和准确的找到WB的问题所在一并保证实验结果的准确性和特异性！ 一般需要设置的-

13、9;.、 丁: 八 -. e t7.阳性对照:；卵桶表达幽蛋白的型织或细胞,用于检测抗体的工作效率 阴性对隰:可神不表达检刑霆白组织或细胞,用于秘II抗体豌鼻除 二抗对照;不加一抗,用于检测二抗的特异性 一 P、jTb ' 口内参对照：检测标本的质量和二抗系统.空白对照：不加一抗和二抗：用于检测膜的性质和封闭的效果WB检测根本过程 1、获取细胞或组织裂解物 1根据检测蛋白的位置选择适宜的裂解buffer：蛋白位置全细胞推荐buffer胞浆Y可溶性蛋白Tris-HCI胞浆Y竹架结合蛋白Tiis-TrironNP-40 or REPA膜蛋白NP-40 or RIPA核蛋白RlPAor核蛋白

14、提取试剂盒线粒体蛋白RIPA or线粒体别离试剂盘;亦可购置商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2选择适宜的蛋白酶抑制剂,预防蛋白降解从而保证检测的准确性!2、蛋白定量常用的俄白定量方法:Br用ford上邳艮Lowry assia、域BCA第say 1定量后,可根嘱姆解蟠本保存在-20鸳/-80备用,也况淀IP 感者直雌行电泳分富董白3、电泳分高蛋白质 1 O ob .具 q 根据待测蛋白状态确定电泳条件:恃测蛋白状态凝胶条件.cS?. T ：上样buffer电泳buffer如也11能小-Denatured复原八变性曾P -藐塞在离碱选T .含洌把*SDSRcdtafed r Nativ

15、e kr复原二不变性含阳微|乙麋媒?1/本含题S不含SDSOxk&£d » Denatured*8 J 3 b b< » ° °、a'r.o. >不还所变性,? °不含供流基乙醇或DTT,含SDS含SDS °«- 4酝M也ed -Native不复原不变性不含后端基乙醇或DTT#不含SDS不含SDS根攀待测蛋白分子呈小确定凝胶浓度蛋白分子量. (kDa) 9L if凝胶浓度?短4-402012-451510-70 e115毋I叫10,."二一 '8明转膜.各种膜的技术参

16、了 %*修翩洞的检测目踊噜测蜜饰渊如髓Hr适的膜类型席丹的转移幽触声pvdf *PVDFMNC1尼龙携灵敏陵和分辨率高高背景低低较高.国白绪台水平100-200ug/cm2f 适用于 SDS 存在.' p <9 LJ *<>, 时与蛋白结合)80-100ug/cm2利OOug/cm2机械强度强干的E慎易脆软而结实溶剂抗性强差t他用箭是否需要期100%甲醛润湿暖冲液润湿缓冲液润湿适用染色方法政体金、丽春红、酰胺黑,印度 星小和斯盍兰,肢体金"丽春红,.酸 胺黑中印度噩轩不能用阴搀子染料适用检测方法显色法、：化学发光一荧光、放射 性一做学窕苑二联速第疫蝴显色法.

17、化学发光%朔后放射性 显色、化学发光、放射性埴用也就普通蚩白wb、糖蛋白检测、a 白周酬穴靠基糊密、重覆检 测普通蛋白WB,氨基 研析箝重复检测? 0.1 um膜适用于7kDa0 W -V vi< p以下蛋白低浓度小分子蛋白、粉性蛋白、糖蛋白、蚩白多糖、核酸检测常用价格南较低低;硝酸纤维素膜NC膜?和尼龙膜.其中PVDF和NC膜的使用频率最高 ee * .ti o Jh o *.数及比拟如下X5、封闭.A 03 Vfl去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景常用的封闭溶液有；含BSA或者脱脂奶粉的 TBST 或 TBS6、一抗孵育 0. f. 4 .«T ,一抗的选择成功与否,

18、是整个WB实验成功的关犍【选择一抗有以下几个注意点:选择适合检测标本种届的一抗?说明书有验证选择适用于WB实验力注的一抗说明书有验证 a °I» a » e oW° * D选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用:根据说明存的要求条件进行抗体的保存:般需要将抗体分甄后放入-20度保存,根对预防反复冻融占抗体的工作液最好现配现用.在4度保存最好不要超过2周O . , O ,4.,根据说明书推苕浓度使用TBST稀释一抗.由于实验空条件和检测方法等的差异,说明书推茬的稀释比例只作参考,.需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然

19、后选择信臊比最好的抗体浓度进行实验事如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行. f a o C ' .Q > #3®<< « a. ：<J. f r c BeI « o < 雌最正确稀释度a：100l：3000 .孵育条件：推荐4y孵育过我一般大于18个小时,根据抗体苫汰小I司幅竹时川,仃所 * M G o 丫7 上», V 9 / * 、区别内参的选择和使用,WB过程监测以及目的蛋白定量的标准!° T:. 工 erf a ?- r； * A 8JWB常用内参及其技术番数：内参名称分子量大小beta-

20、actiii43kDa胞浆和全细胞、解皿具930-40kDa胞浆和全细胞:,Tubulin55kDaVCDAl/Porin31kDa义粒体COXIV!、,丁 ；16kDa '线粒体：TBPkDa细胞核7 .二抗孵行根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗毋如果说明书没有推荐浓度,可进行名个稀释比例进行摸索最正确稀释度f hMMHMQUOOU),孵育条件一般为室温口；2小时 .P 9 一 0 .二 P °C . F130,.,0.<o98 .底物孵育选择显色或者化学发光底物, 一般倾向于化学发光,过敏度高且背景低,节省抗体用量9、结果分析和检测 % 4 F ' .凝

21、胶成像系统检测或者暗宣曝光到胶片 d W., v< < . % , ,: . > o« Note：从封闭开始,每步之间都需要用TBSr进行洗涤,3次,每次5mincR QT=r 0 D P*30 Q 七 °C.&Q H Dona针对样品的常见问41)加蜥林膜UCP2蛋内的W曲crnB期(以下简写成WcMun BE) , 4U 体后深存?未加蛋白酶抑制剂,用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120陪 换了个santa ctoz的一抗仍不行.是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：疑心是样品问题.可能是,晨样品不能反复冻

22、融：2,样品未加蛋白酶抑制剂e同时.建议检查Western Blot过程,提升一抗浓度,对于加蛋白酶抑制碉说,一般加PMSF就) .o.0.0 r ",.< > so >* a可以了肥:最好能多加几种蛋白酶抑制剂占8 同一蛋白样品能同时进柠两种因子的Western Blot检测吗# »« 94 o,4解答?当然可以一有的甚至可以同时测几十种样品HF.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋百节操作福要注意什么?-i解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温相得多,这时最好加£NaF去抑制1 U 、9小0R 0 .W WU.* <T U

23、 >.>/嶙酸化丽的活性.(3)我的样品的蛋百含量很恁,每微升不翦1微克,塾但是在转膜时经常会发现只有一局部 飞,P冷°'f 1».蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了息有 什么方法可以解决? wr p 0、. . cRQ ? . .： , 解答：你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5-10%, ! « 了;, .' % q s %" a "»9 1»0 > <» o ° 甲醇.(4>醯别

24、离的塞自感坪量2随kd甑 械鲤筋庇幽津分匍樽蛾米大有屐？ 蜥睽的 施矍又该闰辞少?:卷玄大分子量的霰母善易他Wes即 W 吗?1 ,° q b 3 f' . p ,.A ' o 解答厂260kd的蛋白不好做,别离胶用6% * Stacking Gel成层股3.5姐.如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要参加上样量使原来弱的条带A 40 0«e . c g a .T 9 . P Ji J , «能看清楚%解答：可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透折掉一局部小分子蛋白,一般地,超载30%是不会有问题的*如果已经超了不少了,而且小分子量的

25、也要,可以考虑加大股的厚皮,可以试试1.5mm的comb,-V U <».：., s 1.(6)眼自变性后可以存放多久？解答, 80匕,一两年没有问题6最美键两条,不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了).(7)我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说别离胶应当采用75%,但我所查资料却要求别离胶和浓缩胶均采用11 %的配方,不知为何解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用,由于105 K D的蛋白在上述两种胶的线性分辨范 国内能但需注意条带位置.蟾下瓣触聋来更a趣显钮温 二就越学蛔幼猱克麟能 三插球晶和触蜘/ 体系艮不知采用这样的方案后才封闭液是杳要作调整孔能否再用

26、5题的脱脂妍粉呢？好似有 资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成.是吗?解答：不能使用脱脂耐,由于脱脂奶粉中含生物素,用B：S A代替摩读好一点.M,还有一问题,一般L次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有美系吗?解答：W网cm Blot 一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗；二二0eL一 .的量和抚育时间都有美系,也与显色肺间长短有关&开始摸条件时,为了拿到阳性结果巨各个步镰都可以量霎一点时间长一点,当然背景也沌出来了一要簟到好的结果,如果抗体好肉 ° t C «oS » ,话比拟容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合Western Blot的怎样做也不 ' . j V 9 . »* 卞 "" 九 嘈 j «,., . " 行.所以学到好的结果不容易.驷)bd即盥耐撇,瞰爵蟒漠谶e辞血螭瑚岫不用獭染色曲蟋有越非普异性.建议：1,换抗侬个人比拟喜费CHEM18N的.5 ANAT